[发明专利]一种耐酸重组乳酸菌及其构建方法

说明书

本发明公开了一种耐酸重组乳酸菌及其构建方法，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明通过在乳酸乳球菌中过量表达RbsA或RbsB蛋白，得到了酸胁迫抗性显著提高的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis(RbsA)以及Lactococcus lactis(RbsB)；利用本发明的方法得到的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis(RbsA)、Lactococcus lactis(RbsB)的耐酸能力均较野生型有了明显的提高，其对乳酸的耐受能力分别较野生型提高了5.2倍、12.2倍。

技术领域

本发明涉及一种耐酸重组乳酸菌及其构建方法，属于基因工程以及微生物工程技术领域。

背景技术

乳酸菌作为一类重要的工业微生物，菌体及其代谢产物被广泛应用于食品、医药、饲料、精细化学品等工业领域中。但是，在乳酸菌的工业化发酵生产以及作为益生菌在人体胃肠道系统发挥作用的过程中，不可避免的面临着来自外界环境的多种环境胁迫，包括酸胁迫、乙醇胁迫、氧胁迫、盐胁迫等，这些环境胁迫均严重限制着乳酸菌生长性能。

而在乳酸菌面临的众多胁迫条件中，酸胁迫是影响其生理活性的重要胁迫条件。因此，提供一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法尤为重要。

酸胁迫是由乳酸菌代谢产物乳酸、乙酸等酸性物质造成的，随着菌体的代谢生长过程，酸性物质也随之产生并积累，这些积累的乳酸、乙酸等酸性物质通过被动扩散进入细胞质，由于胞内的pH通常较胞外的pH高0.5～1.0，进入胞内的乳酸、乙酸等迅速解离，导致胞内pH的快速降低，使得细胞面临严重的酸胁迫，严重影响了细胞的生理活性，大大降低了乳酸菌食品微生物制造的效率，其中，以乳酸的积累导致的酸胁迫是最重要的胁迫之一。

对于酸胁迫，为维持乳酸菌发酵生产的稳定性并提高生产效率，过去，工业上常常通过在乳酸菌发酵的过程中添加外源中和剂来维持pH处于稳定的范围，例如，通过添加碱性物质(氨水或NaOH)来控制发酵环境的pH值。

然而，碱性物质的添加往往会导致副产物的积累，而副产物中形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境，从而造成渗透压胁迫的产生，再次影响菌体的生长与代谢。

目前，提高乳酸菌的乳酸、乙酸等酸胁迫抗性的方法则主要有：(1)诱变育种，该方法具有简便、类型繁多等特点，但工作量大、效率低、成功率低是其主要缺点；(2)生化工程策略，已有报道用过外源添加天冬氨酸以提高乳酸菌的酸胁迫耐受性，但是，利用该方法获得耐酸乳酸菌生产成本过高，也不适用于工业化生产。

因此，急需找到一种耐酸能力强且易获得的乳酸菌以适应工业化生产。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种耐酸能力强且易获得的重组乳酸菌。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种耐酸重组乳酸菌，所述重组乳酸菌过量表达了D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA和/或D-核糖转运底物结合蛋白RbsB。

在本发明的一种实施方式中，编码所述D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述D-核糖转运底物结合蛋白RbsB的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述过量表达为先将编码D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA和/或D-核糖转运底物结合蛋白RbsB的基因与表达载体构建含有编码D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA和/或D-核糖转运底物结合蛋白RbsB的基因的重组质粒，再将重组质粒导入乳酸菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌Lactococcus lactisNZ9000。