[发明专利]人Vγ9Vδ2T细胞的扩增及预处理方法

权利要求书

1.一种人Vγ9Vδ2T细胞的扩增及预处理方法，其特征在于，包括：

步骤1、从人体外周血中提取外周血单个核细胞；

步骤2、提供人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基，采用所述人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基对所述外周血单个核细胞进行重悬，得到细胞悬液；

所述人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基包括人Vγ9Vδ2T细胞培养基以及添加于所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基中的膦酸类化合物；所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基包括基础培养基以及添加于所述基础培养基中的白介素-2；

所述步骤1与步骤2的顺序能够调整或者同时进行；

步骤3、将所述细胞悬液接种到细胞培养容器中培养48-96小时；

步骤4、采用所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基对细胞进行换液，后续培养过程均采用所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基进行；

步骤5、从所述步骤3开始培养8-14天后，获得人Vγ9Vδ2T细胞培养体系，在所述人Vγ9Vδ2T细胞培养体系中加入纳米硒粒子处理6-24小时；

步骤6、去除所述人Vγ9Vδ2T细胞培养体系中未被所述人Vγ9Vδ2T细胞吸收的纳米硒粒子。

2.如权利要求1所述的人Vγ9Vδ2T细胞的扩增及预处理方法，其特征在于，所述纳米硒粒子的粒径为10～300nm。

3.如权利要求1所述的人Vγ9Vδ2T细胞的扩增及预处理方法，其特征在于，所述步骤5中，将所述纳米硒粒子添加至所述人Vγ9Vδ2T细胞培养体系后，所述人Vγ9Vδ2T细胞培养体系中纳米硒粒子的浓度为0.1～10μmol/ml。

4.如权利要求1所述的人Vγ9Vδ2T细胞的扩增及预处理方法，其特征在于，所述纳米硒粒子以悬浮液的形式加入所述人Vγ9Vδ2T细胞培养体系中，所述悬浮液包括磷酸缓冲溶液以及分散于所述磷酸缓冲溶液中的纳米硒粒子。

5.如权利要求1所述的人Vγ9Vδ2T细胞的扩增及预处理方法，其特征在于，所述步骤6中，去除所述人Vγ9Vδ2T细胞培养体系中未被所述人Vγ9Vδ2T细胞吸收的纳米硒粒子的方法包括：将含有纳米硒粒子的所述人Vγ9Vδ2T细胞培养体系置于离心管中进行离心，人Vγ9Vδ2T细胞在离心管底部形成沉淀，未被吸收的纳米硒粒子悬浮于培养基中，之后去除沉淀上方的液体，采用磷酸缓冲溶液对沉淀于底部的人Vγ9Vδ2T细胞进行清洗。

6.如权利要求5所述的人Vγ9Vδ2T细胞的扩增及预处理方法，其特征在于，所述离心的转速为1500-2500r/min，离心时间为5-20分钟。

7.如权利要求1所述的人Vγ9Vδ2T细胞的扩增及预处理方法，其特征在于，所述膦酸类化合物包括唑来膦酸、依替膦酸、伊班膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、利塞膦酸、米罗磷酸中的一种或多种。

8.如权利要求1所述的人Vγ9Vδ2T细胞的扩增及预处理方法，其特征在于，所述步骤2中，所述细胞悬液的细胞密度为3～4×10⁶个/ml。

9.如权利要求1所述的人Vγ9Vδ2T细胞的扩增及预处理方法，其特征在于，所述步骤2中，所述人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基中，膦酸类化合物的浓度为1-200μM；所述人Vγ9Vδ2T细胞刺激扩增培养基与所述人Vγ9Vδ2T细胞培养基中，白介素-2的浓度为1-200ng/ml。

10.如权利要求1所述的人Vγ9Vδ2T细胞的扩增及预处理方法，其特征在于，所述步骤4的后续培养过程中，每隔48-72小时对细胞进行换液。