[发明专利]橘臀纹粉蚧的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针

说明书

本发明公开了一种橘臀纹粉蚧的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针，根据橘臀纹粉蚧的mtDNA中部分基因的序列设计特异性引物PCF3/PCR3和探针PC‑MGB，建立了橘臀纹粉蚧的实时荧光PCR检测方法，以达到快速准确检测鉴定橘臀纹粉蚧，并用于准确区分橘臀纹粉蚧与大洋臀纹粉蚧的目的。

技术领域

本发明涉及农林业和植物检疫技术领域，具体涉及一种橘臀纹粉蚧的实时荧光PCR检测方法；此外，本发明还涉及检测橘臀纹粉蚧的引物和探针。

背景技术

橘臀纹粉蚧Planococcus citris（Risso）又名橘粉蚧、柑橘臀纹粉蚧，隶属于同翅目（Homoptera）粉蚧科（Pseudococcidae）臀纹粉蚧属（Planococcus），是热带、亚热带观赏性植物、水果的主要害虫，其主要为害寄主植物的茎、叶片、花果等幼嫩部位，轻者叶片变黄，重者干枯脱落，使植株发育不良，严重影响水果的经济价值和观赏性植物的品相。同时，橘臀纹粉蚧与另一种重要的检疫性粉蚧大洋臀纹粉蚧P. minor (Maskell)形态相近，且常在一种寄主上混合发生，极易混淆，区分两者难度较大，因此建立快速准确鉴定橘臀纹粉蚧方法十分必要。

《GB/T 35340-2017 大洋臀纹粉蚧和柑橘臀纹粉蚧检疫鉴定方法》中列出了区分大洋臀纹粉蚧和橘臀纹粉蚧的传统形态学鉴定方法，传统形态学鉴定方法需2—3天，鉴定时间长；传统形态学检测方法需要先制作玻片，观察形态学特征才能鉴定，并且鉴定者需要一定鉴定经验，存在人工误差，影响鉴定准确率。

中国专利申请CN2011100500314公开了南洋臀纹粉蚧的实时荧光PCR引物、探针及检测方法，其检测目标是南洋臀纹粉蚧，与本发明的检测目标橘臀纹粉蚧种类不同，且设计的引物和探针、PCR反应体系和反应条件均不同。南洋臀纹粉蚧与橘臀纹粉蚧在外部形态上有区别，因此容易区分。

本发明橘臀纹粉蚧与大洋臀纹粉蚧不仅在外部形态上近似，两者在分子水平上的差异也较小，这对橘臀纹粉蚧实时荧光特异性Taqman探针的设计造成一定难度，是本领域的技术难题。因此，本领域亟需解决这一技术难题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种橘臀纹粉蚧的实时荧光PCR检测方法；为此，本发明还提供用于上述方法的检测引物和探针。利用橘臀纹粉蚧检测引物及探针可以快速、准确地对橘臀纹粉蚧进行检测鉴定。

本发明根据橘臀纹粉蚧的mtDNA中部分基因的序列设计特异性引物和探针，建立了橘臀纹粉蚧的实时荧光PCR 检测方法，以达到快速准确检测鉴定橘臀纹粉蚧的目的。

在本发明的一方面，提供一种橘臀纹粉蚧的实时荧光PCR检测方法，包括如下步骤：

(1) 设计引物和探针；

该引物的序列为：

上游引物PCF3：5’- GATTTTGATTATTAATTCCATCAC -3’ ， 如SEQ ID NO：6所示序列或其互补链；

下游引物PCR3：5’- TTGGATTACCATTTCCTAATGG -3’ ， 如SEQ ID NO：9所示序列或其互补链；

该探针的序列为：

橘臀纹粉蚧探针PC-MGB：5’- TTGAACACTTTACCCTCCTTTA-3’， 如SEQ ID NO：10所示序列或其互补链；荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭基团连接在3’末端；

(2) 提取橘臀纹粉蚧DNA；

(3) 采用步骤（1）设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测，用以区分橘臀纹粉蚧与大洋臀纹粉蚧。

作为本发明优选的技术方案，步骤（2）具体为：取橘臀纹粉蚧单头虫样放入研钵，加液氮磨成粉末状，用试剂盒提取样品DNA。