[发明专利]一种SD大鼠星形胶质细胞培养方法

说明书

发明提供了一种SD大鼠星形胶质细胞培养方法，本方法操作简单，具有较高的可重复性；通过使用专用培养基，星形胶质细胞生产效果好，保证了星形胶质细胞的纯度。本发明能够简便、高效、经济的获得大量功能活性正常的SD大鼠星形胶质细胞，便于直接在纯净的体外细胞培养模型中进一步研究星形胶质细胞的生理功能。

技术领域

本发明涉及一种细胞的分离纯化及培养方法，具体涉及一种SD大鼠星形胶质细胞培养方法。

背景技术

星形胶质细胞（Astroglia），是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，也是胶质细胞中体积最大的一种。用经典的金属浸镀技术（银染色）显示此类胶质细胞呈星形，从胞体发出许多长而分支的突起，伸展充填在神经细胞的胞体及其突起之间，起支持和分隔神经细胞的作用。

细胞突起的末端常膨大形成脚板(foot plate)或称终足(end foot)，有些脚板贴附在邻近的毛细血管壁上，因此这些脚板又被称为血管足或血管周足，靠近脑脊髓表面的脚板则附着在软膜内表面，彼此连接构成胶质界膜(glia limitans)。

对星形胶质细胞进行分离、体外培养，便于神经科学研究中细胞生物学实验的需求。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了一种SD大鼠星形胶质细胞培养方法，具体技术方案如下：

一种SD大鼠星形胶质细胞培养方法，包括以下步骤：

DMEM/F12完全培养基配制：

超净工作台内取88ml DMEM/F12基础培养基于无菌、干净的瓶内，加入10ml FBS、1ml青链霉素双抗、1ml谷氨酰胺，0.22um过滤器过滤后转移至新的瓶内，盖紧瓶盖；瓶子上标明培养基名称、配制日期、配制人后缠紧封口膜，4度冰箱保存备用；

星形胶质细胞培养：

步骤A：取刚出生1天的新生SD大鼠4只，体积百分比为75%的乙醇浸泡淹死；

步骤B：取四个10cm培养皿，每个皿内加入约10ml解剖液；

步骤C：将步骤A中得到的新生SD大鼠放入第一个培养皿中，让解剖液充分浸泡新生SD大鼠，将新生SD大鼠头部取下；

步骤D：将步骤C中取下的头部转移到第二个盛有解剖液的培养皿内，除去头部皮肤；

步骤E：将步骤D中除去头部皮肤的大鼠头部使用显微镊撕开颅骨，撕开颅骨后，用眼科镊固定住头部，用显微镊撕掉颅骨，暴露出整个大脑；

步骤F：将步骤E中取得的大脑转移至第三个盛有解剖液的培养皿内，体式显微镜下找到脑膜，用显微弯镊固定住脑部，用显微直镊撕除脑膜；用显微剪轻轻剪下大脑皮层组织，取材厚度0.5mm，放入第四个盛有解剖液的培养皿内，转移至超净工作台内；

步骤G：将取下来的大脑皮层组织在解剖液内剪成约0.5mm³大小，用巴氏吸管将组织块连同解剖液转移至15ml离心管内；1000rmp/min离心3min，弃上清；用2ml DMEM/F12完全培养基重悬组织块，巴氏吸管轻轻吹打成单细胞悬液；

步骤H：在六孔板每孔接种10⁶个细胞。接种细胞后培养箱内培养24h，24h后换液除去未贴壁细胞，随后每2-3天换液一次；接种24h后细胞开始贴壁，细胞梭型，透光性良好；72h时可见少数细胞长出伪足，但细胞形态未完全伸展开；7天左右时可见所有细胞都已经长出形态，部分细胞形态已经完全伸展开；10天左右时所有细胞形态已经完全伸展开，培养完成。

进一步优选的是，所述步骤C中，用眼科镊固定住新生SD大鼠头部，用小剪刀沿颈部将整个头部取下。

进一步优选的是，所述步骤D中，用眼科镊固定住新生SD大鼠头部，用显微镊撕去头部皮肤。