[发明专利]一种病毒灵人工抗原的合成方法

说明书

一种病毒灵人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以病毒灵与对醛基苯甲酸反应得到具有羧基的产物为半抗原，用碳二亚胺法将半抗原与载体蛋白偶联，用紫外法测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了病毒灵人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原。

技术领域

本发明涉及一种病毒灵人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

病毒灵(Moroxydine)对多种病毒（包括甲型H1N1流感、流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、冠状病毒、腺病毒等）有抑制作用。用于流感、流行性腮腺炎、水痘、疱疹、滤泡性结膜炎等的防治。近年来，人们对长期低水平摄入病毒灵残留所致的各种慢性疾病和诱导病原菌产生耐药性等问题特别关注。2014年，全国多地爆出幼儿园擅自给孩子服用病毒灵，导致孩子出现不良反应。因此，建立快速有效的检测病毒灵含量的方法具有重要意义及市场价值。

酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，然而得到高亲和力和高特异性的单克隆抗体是免疫学检测的前提，人工抗原的合成是其中重要的一步。

发明内容

本发明的目的是提供一种病毒灵人工抗原的合成方法，所制备的产品用于病毒灵免疫分析方法研究，为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。

本发明的技术方案，一种病毒灵人工抗原的合成方法，其由病毒灵与对醛基苯甲酸反应得到具有羧基的产物，即半抗原4cpABOB，用碳二亚胺法将半抗原4cpABOB与载体蛋白偶联，即得到病毒灵人工抗原；步骤为：

（1）半抗原4cpABOB的合成：

合成路线如下：

将化合物 对醛基苯甲酸（4-CBA） 0.65 g于25 mL的圆底烧瓶中，加入纯水10mL，1MHCl溶液3mL于圆底烧瓶中；在磁力搅拌器搅拌下，向体系缓慢滴加DMF直至4-CBA完全溶解。

加入1g盐酸吗啉胍（ABOB·HCl）溶解后，置于60℃水浴锅中磁力搅拌，接好冷凝装置回流过夜，产生白色浑浊。

将反应液5000rpm离心10min,弃上清，将白色固体置于滤纸上，用纯水过滤洗涤3次，最后置于60℃烘箱烘干，即得到产物半抗原4cpABOB。

（2）完全抗原的制备：步骤（1）制备的半抗原4cpABOB，与BSA偶联得到偶联物完全抗原4cpABOB-BSA；或与OVA偶联得到偶联物完全抗原4cpABOB-OVA。

所述完全抗原4cpABOB-BSA制备方法如下：

a、称取步骤（1）制备的1.8 mg4cpABOB，1-乙基碳二亚胺盐酸盐2.1 mg，N-羟基琥珀酰亚胺1.3 mg，用400μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解(称为A液)，室温搅拌反应4-5h。称取牛血清蛋白BSA 6 mg(4cpABOB与BSA摩尔比为30:1),加入等体积碳酸缓冲溶液（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物4cpABOB-BSA混合液；

b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物4cpABOB-BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原4cpABOB-BSA。

病毒灵人工抗原的鉴定：

（1）采用核磁共振和液质联用技术鉴定半抗原。

（2）人工抗原采用紫外法鉴定其偶联结果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。