[发明专利]一种筒状蛋白纳米反应器在显色检测中的应用

权利要求书

1.一种筒状蛋白纳米反应器在显色检测中的应用，其特征在于，以四甲基联苯二胺为发色底物，在筒状蛋白纳米反应器内，H₂O₂还原成H₂O，四甲基联苯二胺被氧化为蓝色的二亚胺化合物，644nm处产生特征吸收峰；加入浓硫酸后，显色反应终止，通过450nm处的吸收峰进行定量分析；

所述筒状蛋白纳米反应器主体为两端开口的筒状蛋白，并且筒状蛋白两端开口处内表面通过疏水作用结合具有催化活性的疏水客体；所述筒状蛋白的筒壁为多孔结构；

显色检测具体步骤为：

将20μM筒状蛋白纳米反应器溶液与3mM四甲基联苯二胺溶液等体积混合，静置10min，得到混合液；

之后加入所述混合液一半体积的含H₂O₂的溶液，30℃水浴锅中孵育20min；

孵育后加入体积分数20％的硫酸终止显色反应，利用紫外可见分光光度计测量450nm处的吸光度；以H₂O₂浓度为横坐标，450nm处的吸光度为纵坐标绘制标准曲线；

检测未知溶液中H₂O₂含量时，测定450nm处的吸光度值，根据标准曲线即可推算出H₂O₂浓度；

所述筒状蛋白纳米反应器内径4.5nm，外径14nm，高14.6nm；

所述筒状蛋白纳米反应器的制备方法包括如下步骤：

(1)以pET-28a+为载体将SEQ ID NO:1所示基因转入大肠杆菌菌株C41(DE3)中，构建得到工程菌；对工程菌进行扩大培养，诱导筒状蛋白表达，提取纯化筒状蛋白；

(2)将具有催化活性的疏水客体分散于含Tween80的氢氧化钠溶液中，得到疏水客体胶束母液；稀释疏水客体胶束母液，并与筒状蛋白溶液等体积混合，装入透析袋中，置于缓冲液中充分透析，得到筒状蛋白纳米反应器；

所述步骤(1)具体为：

合成SEQ ID NO:1所示目的基因，通过NcoI和HindIII两个酶切位点连接到质粒pET-28a+中，通过热激法将含有目的基因的pET-28a+转入大肠杆菌C41(DE3)中；

挑选转化成功的单克隆接种到LB培养基中进行扩大培养，当菌液OD₆₀₀达到1.5-2.0时，加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，25℃下诱导C41(DE3)进行蛋白表达；

诱导12-14小时后，离心收集菌体，在pH为7.5的50mM Tris-HCl缓冲溶液中重新悬浮菌体，利用高压破碎仪对菌液进行破碎；破碎后离心取上清液，0.45μm滤膜过滤；收集过滤液，先后使用阴离子交换柱和凝胶色谱柱对蛋白进行纯化，最后得到纯度>95％的筒状蛋白；

所述步骤(2)将1mM疏水客体分散于含1.5mM Tween80的15mM氢氧化钠溶液中，得到疏水客体胶束母液；将疏水客体胶束母液用pH7.5的50mM Tris-HCl缓冲溶液稀释至100μM，与1μM筒状蛋白溶液等体积混合，装入25kDa透析袋中，置于pH7.5的50mM Tris-HCl缓冲溶液中透析48h，得到筒状蛋白纳米反应器；

所述疏水客体为铁卟啉。