[发明专利]联合EpCAM单链抗体和CCL19杀伤乳腺癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用

说明书

本发明属于医药生物领域，具体涉及联合EpCAM单链抗体和CCL19杀伤乳腺癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用。该CAR载体包括EpCAM单链抗体和趋化因子CCL19，其中CAR结构为CD8leader‑EpCAM scfv‑CD8α‑CD28‑CD137‑CD3ζ‑IRES‑CCL19，以病毒感染方式获得含有该治疗载体的T细胞，即CAR‑T细胞(Chimeric Antigen Receptor T‑Cell)，通过表达CAR结构，靶向识别和杀伤EpCAM阳性表达的乳腺癌细胞。趋化因子CCL19趋化T细胞浸润肿瘤组织，使CAR‑T细胞表现出更强的肿瘤细胞杀伤能力。

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体涉及联合EpCAM单链抗体和CCL19杀伤乳腺癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用。

背景技术

乳腺癌做为一种威胁女性身心健康的常见肿瘤，其发病率约占全身恶性肿瘤的23％，死亡率占14％。目前乳腺癌的治疗方法主要包括手术、放疗、化疗或联合治疗，但治疗效果有限；基因治疗做为新型治疗手段，由于无法确定靶向致病基因，目前尚无突破性进展。其次，肿瘤异质性和肿瘤微环境的复杂性意味着依靠单一方法治愈乳腺癌的机会是微乎其微的。在多学科综合治疗的今天，新的治疗方式亟待提出。

LAK细胞、DC、CIK细胞都曾作为肿瘤的免疫治疗手段，但是以上各种治疗方法均缺乏特异性识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)和杀伤特定肿瘤靶细胞的能力；而肿瘤免疫编辑的过程又会使靶细胞表面的主要组织相容性复合物(mainhistocompatibility complex，MHC)在肿瘤细胞表面表达下降，形成免疫逃逸，使肿瘤细胞可成功躲避T细胞攻击。

嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法是通过基因工程技术在T细胞表面人为过表达能识别特定的肿瘤表面抗原的单链抗体可变区基因片段，从而使T细胞识别特定抗原、杀伤表达该抗原的靶细胞。同时，由于CAR-T细胞是采用抗体识别抗原模式，因此不受MHC的限制。

上皮特异性粘附分子(EpCAM,Epithelial cell adhesion molecule)是一种上皮细胞跨膜糖蛋白，参与Wnt信号转导通路，调控靶基因转录，与细胞的粘附、迁移、增殖、分化等有关。最初是以一种肿瘤相关抗原而被发现的，由于EpCAM在多种肿瘤组织如卵巢癌、胃癌、结直肠腺癌、乳腺癌等中的表达升高而备受关注。研究发现，EpCAM的表达与卵巢肿瘤的进展及预后相关，可作为乳腺癌靶向治疗的靶点。

趋化因子的主要作用是趋化细胞的迁移，细胞沿着趋化因子浓度增加的信号向趋化因子源处的迁徙。有些趋化因子在免疫监视过程中控制免疫细胞趋化，如诱导淋巴细胞到淋巴结。这些淋巴结中的趋化因子通过与这些组织中的抗原提呈细胞相互作用而监视病原体的入侵。这些被称为稳态趋化因子，其产生无需刺激而分泌。人趋化因子c-c-基元配体19(CCL19)是趋化因子CC家族成员，其体外被证实可以通过CCL19/CCR7途径下调β-catenin蛋白表达，而β-catenin蛋白为一种经典的促癌蛋白，由此，可以推测CCL19可以直接作用于肿瘤细胞。

由此，如何有效避免肿瘤免疫逃逸，增强T淋巴细胞对乳腺癌细胞的杀伤，从而提高CAR-T免疫疗法抗乳腺癌的效果，成为CAR-T治疗的一个技术难题。

发明内容

本发明目的是为了解决上述问题，本发明提供了能靶向EpCAM并联合CCL19杀伤乳腺癌细胞的CAR载体。本发明针对乳腺癌细胞特异性蛋白EpCAM避免肿瘤免疫逃逸机制；通过趋化因子CCL19增强T淋巴细胞对乳腺癌细胞的杀伤，从而提高CAR-T免疫疗法抗乳腺癌的效果。此外，还包括联合EpCAM单链抗体和CCL19杀伤乳腺癌细胞的CAR载体的构建方法及其应用。

本发明提供的联合EpCAM单链抗体和CCL19杀伤乳腺癌细胞的CAR载体具体技术方案如下：