[发明专利]从胎膜中分离培养间充质干细胞的方法

说明书

本发明提供了一种从胎膜中分离培养间充质干细胞的方法，包括以下步骤：分离组织、清洗、培养、传代、冻存。本发明提供了一种从胎膜中分离出羊膜、平滑绒毛膜和壁蜕膜三种组织来源的间充质干细胞的方法，改变了现有的取材部位，简化了分离工艺。本发明采用组织块贴壁法提取间充质干细胞，提取工艺简单快捷，无需引入外源酶，降低了外源物对细胞制剂质量产生影响的风险，且制备的细胞活性佳，纯度高，增殖能力更强。

技术领域

本发明属于间充质干细胞技术领域，具体涉及一种从胎膜中分离培养间充质干细胞的方法。

背景技术

胎膜与胎儿的发育密切相关，其构成围绕并保护胎儿的羊膜腔，从子宫壁分离后的胎膜厚度约为200-300μm，由羊膜/中间海绵层/平滑绒毛膜/滋养层/壁蜕膜构成；目前已有研究表明人羊膜，绒毛膜及壁蜕膜中都含有较丰富的间充质干细胞，间充质干细胞是一种多能基质细胞，具有很强的自我更新能力和多项分化潜能，能够分化成成骨细胞，软骨细胞和脂肪细胞，在临床上有广泛的应用前景。

现有的间充质干细胞的分离过程常引用外源酶消化组织块，但该分离过程繁琐，操作时间长，且外源酶的残留还会对细胞质量产生影响。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种从胎膜中分离培养间充质干细胞的方法，该方法操作简单，分离过程中无需引入外源酶，制得的间充质干细胞活性好。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种从胎膜中分离培养间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

(1)从胎膜组织中分离羊膜，平滑绒毛膜及壁蜕膜组织；

(2)将步骤(1)所得的羊膜，平滑绒毛膜及壁蜕膜组织剪成组织块，加入组织清洗液进行清洗；

(3)向清洗好的羊膜，平滑绒毛膜及壁蜕膜组织中分别加入无血清培养基进行重悬，然后接种至培养瓶中，在37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下进行培养；

(4)每隔3-4天更换一次培养基，直至P0代细胞融合度达到40-50％或非P0代细胞融合度达到70-85％；

(5)对步骤(4)所得细胞进行消化，用无血清培养基终止消化，然后过100μm孔径的筛网去除组织，再对细胞悬液进行稀释，离心，重悬，接种至培养瓶中进行传代培养；

(6)待传代后的细胞融合度达到70-90％时，对步骤(5)所得细胞进行消化，收集细胞，加入PBS或0.9％氯化钠注射液，清洗细胞，然后将预冷的细胞冻存液加入细胞中，重悬细胞，然后分装，放入梯度冻存盒中冻存。

进一步地，步骤(1)具体过程为：剪取胎盘边缘的胎膜组织，用组织清洗液对胎膜组织进行清洗，洗去血液，然后用组织镊剥离羊膜，平滑绒毛膜及壁蜕膜组织，分别对这三种组织进行清洗，并剔除血管等其他组织；

进一步地，组织清洗液为PBS溶液或0.9％氯化钠注射液中加入抗菌-抗真菌剂(三抗)，抗菌-抗真菌剂占总溶液体积的1％。

进一步地，无血清培养基为含1％GlutaMAX(Gibico，CTS^TM GlutaMAX^TM-ISupplement，货号为A1286001)的MesenCult^TM-ACF培养基。

进一步地，步骤(3)中接种密度为5-7mg/cm²，培养基体积与接种面积比为1:15-18。

进一步地，步骤(5)中接种密度为7×10³-1.2×10⁴个/cm²。

进一步地，步骤(5)和步骤(6)中采用0.25％胰蛋白酶对细胞进行消化。