[发明专利]一种基于高通量测序检测丛枝菌根真菌的引物及检测方法

权利要求书

1.一种基于高通量测序检测丛枝菌根真菌的检测方法，其特征在于，包含以下步骤：

步骤1：以待鉴定植物或土壤中的DNA为模板，用

引物一：5’-CCGCTGAACTTAAGCATATC-3’

引物二：5’-AGCTGCAWTCCCAAACAACT-3’

连接适用于高通量测序的通用接头后进行第一轮PCR扩增，得到两端带通用接头的一轮PCR产物；以一轮PCR产物为模板，用PCR产物的5’端带测序接头和index的通用引物进行二轮PCR扩增，得到两端带测序接头和index序列的二轮产物；

步骤2：对所述二轮PCR扩增产物纯化后进行高通量测序，将高通量测序所得的数据Rawdata经过处理转化为Cleandata；

步骤3；将Cleandata中的序列与具有明确注释信息的丛枝菌根真菌28SrRNA相应的序列进行比对，通过设置比对的相似度大于等于97%和覆盖率大于99.6%，小于100.4%，筛选出在这个条件下的序列，将筛选到的序列与相似度最高的丛枝菌根真菌参照序列在NCBI中进行一对一的Blast比对，得出用于注释的e-value；

步骤4：根据相似度，覆盖率和e-value将筛选到的序列注释到属一级，从而实现样本中丛枝菌根真菌的检出和鉴定。

2.根据权利要求1所述的基于高通量测序检测丛枝菌根真菌的检测方法，其特征在于：所述PCR扩增的体系为：Pusion Hot start flex 2X Master Mix 12.5μl，Forward Primer2.5μl，Reverse Primer 2.5μl，Template DNA 50 ng，加ddH₂O至25μl。

3.根据权利要求1所述的基于高通量测序检测丛枝菌根真菌的检测方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应条件为：98℃预变性30秒；然后按照下列参数进行循环反应：98℃变性10秒，54℃复性30秒，72℃延伸45秒；循环35次；循环反应结束后在72℃保持10分钟，将得到反应产物在4℃保存。

4.根据权利要求1所述的基于高通量测序检测丛枝菌根真菌的检测方法，其特征在于：所述丛枝菌根真菌的检测范围包括以下属：Gigaspora、Dentiscutata、Scutellospora、Racocetra、Rhizophagus、Glomus、Kamienskia、Dominikia、Funneliformis、Septoglomus、Acaulospora、Sacculospora、Pacispora、Diversispora、Otospora、Redeckera、Corymbiglomus、Claroideoglomus、Ambispora、Archaeospora、Palaeospora。

5.根据权利要求1所述的基于高通量测序检测丛枝菌根真菌的检测方法，其特征在于：所述步骤2中的纯化方式为过柱纯化，乙醇/醋酸钠纯化，SAP-Exon I纯化方式中任意一种方式。

6.根据权利要求1所述的基于高通量测序检测丛枝菌根真菌的检测方法，其特征在于，所述引物二中的W为简并引物，该位点A和T等比例混合，其比例为1：1。