[发明专利]一种抑制兔Deptor基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种抑制兔Deptor基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用。所述shRNA为pSicoR‑shRNA‑508，由siRNA正义链、loop环、siRNA反义链和终止信号组成。所述shRNA能有效稳定地抑制兔Deptor基因的表达，可通过抑制Deptor基因表达探讨其对外源目的基因表达效率的影响及其作用机理，进一步验证Deptor基因对兔胚胎干细胞多能性维持和自噬通路相关基因表达的影响，为兔胚胎干细胞稳定建系奠定基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种抑制兔Deptor基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

Deptor是一个来源于DEPDC6基因(NCBI gene ID 64798)的48kDa蛋白质。Peterson 等人在mTOR的免疫沉淀中鉴定出了此蛋白，因此蛋白N末端串联了两个DEP结构域，又与mTOR有相互作用，于是将其蛋白命名为Deptor。Deptor的C末端含有PDZ结构域，调节Deptor与mTOR蛋白质的C端区域的互作作用。Deptor是mTOR复合物mTORC1/2 的组成成分，并对这两个复合物起负调控作用。干扰Deptor的表达，mTORC1/2下游信号传导底物的磷酸化增加，相反，Deptor的过表达抑制mTORC1/2下游的信号传导。在缺乏生长因子或存在mTOR抑制剂的情况下，mTOR-Deptor的结合被强化，从而降低mTOR 活性。另外，Deptor也是一种磷酸化蛋白，可以进行翻译后修饰，从而影响其与mTOR 的结合。在生长因子的刺激下，激活的RSK1和S6K1会使Deptor磷酸化，磷酸化的Deptor 会被泛素蛋白酶体系统迅速降解，从而提高mTOR的活性。

在生物体内，Deptor主要在内分泌腺表达。在癌症上，Deptor在不同的组织或细胞中，可以表现为致癌基因或抑癌基因。在大多数癌症中Deptor表达量低，但在多发性骨髓瘤亚群中表达量高，在这些细胞中，Deptor的高表达对维持PI3K和AKT活化是必要的， Deptor表达水平降低将导致细胞凋亡。Deptor作为天然的mTOR抑制剂，通过调节细胞自噬相关通路调节细胞生长、凋亡、自噬和内质网应激。近年，有报道称Deptor能作为一个核蛋白与DNA结合，调控基因的转录。Deptor能调节内质网内稳态相关基因转录，其下调则会促进内质网应激的发生，诱导凋亡产生。

近年有报道，mTOR复合物中的Deptor不仅仅定义为mTOR的抑制剂。Deptor可能作为一个干细胞因子，与其他多能因子组成干细胞调控自噬网络，直接参与多能干细胞的干性。对Deptor基因启动子进行预测，发现启动子区含有Oct4结合的区域，也含Sox2 结合区域，推测Deptor可能受Oct4、Sox2调控。依据前人的报道，mTOR通路对干细胞多能性的维持有重要作用，而mTOR复合物中Deptor是mTOR天然抑制因子，同时也被报道为潜在的干细胞因子。由此，推测Deptor对干细胞的多能性具有调节作用。因此，有必要进一步研究Deptor基因对兔胚胎干细胞(Rabbit Embryonic Stem Cells，rbESCs) 多能性的影响，为rbESCs建系和丰富多能性调控网络奠定基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能有效稳定地抑制兔Deptor基因表达的shRNA，可通过抑制Deptor基因表达探讨其对外源目的基因表达效率的影响及其作用机理。

本发明的目的在于提供一种shRNA。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述shRNA的重组慢病毒表达载体。

本发明的另一目的在于提供上述重组慢病毒表达载体的构建方法。

本发明的另一目的在于提供一种慢病毒颗粒。

本发明的另一目的在于提供一种基因工程化的兔胚胎干细胞。