[发明专利]一种低成本、简单快速的糖蛋白N-糖链分析方法

说明书

本发明提供了一种低成本、简单快速的糖蛋白N‑糖链定量分析方法，它包括如下步骤：(1)糖蛋白加热变性后进行还原烷基化处理；(2)在超滤管中使用PNGase F蛋白酶切除糖肽上的N‑糖链，离心收集N‑糖链；(3)使用亲水作用色谱纯化富集N‑糖链；(4)去除唾液酸后，干燥浓缩；(5)基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析N‑糖链。本发明操作简单、快速，可广泛适用于不同来源的糖蛋白的N‑糖链的分析，分析结果稳定可靠，应用前景广。

技术领域

本发明涉及生物化学领域，尤其涉及一种糖蛋白N-糖链分析方法。

背景技术

糖蛋白上连接的N-糖链是由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、N-乙酰葡萄糖、N-乙酰半乳糖、唾液酸等单糖通过糖苷键连接而成的分子。N-糖链在内质网表面经糖基转移酶催化，与新生成的蛋白质上的天冬酰胺残基通过N-糖苷键连接，并进入内质网和高尔基体内发生一系列后续加工。N-糖基化通常发生在保守的氨基酸序列N-X-T/S(X≠P)中，根据五糖核心外围糖链的延长方式不同，其又可以分为高甘露糖型、杂合型以及复合型，不同的糖链结构各自发挥重要的调控功能。大量研究结果表明，细胞表面N-糖链异常变化与肿瘤细胞的侵袭和转移等有密切关系。研究N-糖链的结构变化对于阐明糖链在肿瘤和疾病发生发展中的作用，糖链标志物的发现以及早期诊断、治疗乃至药物的研发具有重要意义。

但是N-糖链分析难度较大，主要在于其含量低、种类和结构复杂、异质性等，因此N-糖链定量分析的前处理(纯化)显得尤为重要公告号为CN 102788720 B的专利文件(一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全N-接糖链及其鉴别方法)公开了一种N-糖链纯化及分析方法，其通过PNGase F酶切割N-糖链，用10KD分子筛过滤得到N-糖链粗提液后，使用Sepharose 4B在离心管中纯化N-糖链；然后通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对其进行分析。但最终产生的N-糖链的质谱信号偏弱，鉴定的糖链种类偏少。

发明内容

为了增强N-糖链的质谱检测信号，本发明首先提供了一种低成本、简单快速的糖蛋白N-糖链定量分析的前处理方法，它包括如下步骤：

(1)糖蛋白加热变性后进行还原烷基化处理；

(2)在超滤管中使用PNGase F蛋白酶切除糖肽上的N-糖链，离心收集N-糖链；

(3)使用亲水作用色谱纯化富集N-糖链；

(4)去除唾液酸后，干燥浓缩。

前述的前处理方法，步骤(1)所述的还原烷基化处理为：分别使用二硫苏糖醇和碘乙酰胺处理。

进一步地，所述二硫苏糖醇处理为：50-60℃振荡反应30-60min。

进一步地，所述碘乙酰胺处理为：加入终浓度30-70mmol/L碘乙酰胺在室温避光反应0.5-1.5h。

前述的前处理方法，步骤(2)所述的酶切反应在条件是：酶用量：每20μg糖蛋白使用1U的酶；反应温度：37℃；反应时间：2h。

前述的前处理方法，步骤(3)使用的色谱填料是博纳爱杰尔的Venusil HILIC填料。

前述的前处理方法，步骤(2)结束后要对N-糖链冻干，使用平衡液复溶后进入步骤(3)；所述平衡液为80％(v)乙腈和0.2％(v)三氟乙酸的混合溶液。

前述的前处理方法，其特征在于，步骤(3)为：上样后，使用平衡液洗杂质，再用0.1％(v)的三氯乙酸溶液洗脱N-糖链。

前述的前处理方法，步骤(3)在移液枪枪头中进行；所述移液枪枪头内部的前端固定有C8固相萃取盘片；所述盘片起筛板的作用。

前述的前处理方法，步骤(4)所述的去除唾液酸的方法为：在三氟乙酸环境中加热到70-100℃，维持20-40min。