[发明专利]去除炭疽芽胞杆菌中pXO1质粒的方法

说明书

本发明公开了去除炭疽芽胞杆菌中pXO1质粒的方法。本发明公开的去除炭疽芽胞杆菌中pXO1质粒的方法，采用CRISPR/Cas9系统完成，CRISPR/Cas9系统中包含名称为sgRNA1的sgRNA，sgRNA1识别的靶序列为pXO1质粒含有而炭疽芽胞杆菌不含有的特异序列，靶序列为序列表中序列3的第1‑20位所示的DNA片段。本发明采用CRISPR/Cas9系统进行炭疽芽胞杆菌毒力大质粒pXO1质粒的去除，成功得到了不含有pXO1质粒的炭疽芽胞杆菌，本发明的方法操作简单，为构建新的疫苗株提供了更快捷、更方便新的手段，为炭疽芽胞杆菌的防治提供了新的思路。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，去除炭疽芽胞杆菌中pXO1质粒的方法。

背景技术

炭疽芽胞杆菌(也称为炭疽芽胞杆菌)是一种革兰氏阳性、能形成芽胞的需氧杆菌，能够引起人畜的炭疽病，如果不及时治疗，死亡率极高,造成极大经济损失，威胁生命安全。炭疽杆菌含有两个致病相关的毒力大质粒：pXO1(181.6kb)和pXO2(96.2kb)。质粒pXO1编码保护性抗原、致死因子和水肿因子等炭疽毒素蛋白及它们的调控蛋白。质粒pXO2编码参与荚膜形成和降解的基因。这两个质粒对于炭疽杆菌的致病性至关重要，丢失任何一个质粒都会导致炭疽杆菌的毒力极大的减低。因此对于炭疽杆菌毒力大质粒的研究一直是研究的热点。构建去除毒力质粒的突变菌株对于研究质粒在炭疽杆菌致病中的作用及与染色体的相关调控非常重要。

早期去除细菌的大质粒可以使用化学试剂，比如吖啶橙、新霉素、溴化乙啶等。高温培养或紫外照射等方法。但是这些方法都有潜在的问题，第一是特异性差，即在去除目的质粒的过程中可能去除目的质粒以外的其他质粒，第二是可能在处理过程中宿主细胞产生随机突变的可能性。

CRISPR/Cas系统是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构，被认为是原核生物防御外来噬茵体、质粒或其他外源DNA侵染的获得性免疫系统，该系统中的crRNA在一个反式激活crRNA(tracrRNA)的辅助下，募集效应蛋白(Cas蛋白)并把它们带到靶标DNA序列，Cas蛋白利用其核酸酶的功能切割外源DNA序列，引起DNA双链断裂(Double StrandBreak,DSB)。目前该系统已经被广泛利用进行基因编辑。为了更方便简单的利用该系统，研究人员将II型CRISPR/Cas9系统中的crRNA-tracrRNA双链RNA复合体人工改造为一条嵌合的单链RNA，被称为单向导RNA(single guide RNA，sgRNA)，依靠其5’端20nt(即为spacer序列，这里称为N20)的特异性的序列配对来靶向DNA位点，靶DNA序列3’末端的PAM(5’-NGG-3’)为Cas9识别位点，不能包含在sgRNA之中。应用的时候只需更换sgRNA的5’末端的N20序列就能够指导Cas蛋白切割不同的目标DNA序列。2013年该系统率先应用到人类和小鼠胚胎干细胞的基因编辑中，目前已经成功应用到小鼠、猪、食蟹猴、斑马鱼、拟南芥、高粱、烟草、水稻、线虫、酵母、大肠杆菌等多种动植物和微生物中，成为生物学和医学各领域广泛应用的基因编辑工具。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何去除炭疽芽胞杆菌pXO1质粒。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种去除炭疽芽胞杆菌中pXO1质粒的方法，所述方法采用CRISPR/Cas9系统去除出发炭疽芽胞杆菌中pXO1质粒，所述CRISPR/Cas9系统中包含名称为sgRNA1的sgRNA，所述sgRNA1识别的靶序列为pXO1质粒含有而炭疽芽胞杆菌不含有的特异序列。

所述出发炭疽芽胞杆菌含有pXO1质粒。所述出发炭疽芽胞杆菌可含有pXO1质粒，不含有pXO2质粒。

在本发明的一个实施例中，所述出发炭疽芽胞杆菌为A16PI2。

上述方法中，所述靶序列可为如下A1)、A2)或A3)：

A1)序列表中序列3的第1-20位所示的DNA片段；