[发明专利]一种双向表达T载体以及其制备方法和应用在审
| 申请号： | 201910031424.7 | 申请日： | 2019-01-14 |
| 公开（公告）号： | CN109913484A | 公开（公告）日： | 2019-06-21 |
| 发明（设计）人： | 王珊珊 | 申请（专利权）人： | 陕西理工大学 |
| 主分类号： | C12N15/63 | 分类号： | C12N15/63;C12N15/65 |
| 代理公司： | 北京一格知识产权代理事务所(普通合伙) 11316 | 代理人： | 赵永伟 |
| 地址： | 723001 陕西省汉中市汉台*** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 强启动子 终止子 制备方法和应用 反向连接 高效表达 基因容量 基因文库 外源基因 线性质粒 转化效率 上游 高通量 构建 质粒 基因 | ||
1.一种双向表达T载体，为两个末端的3’端均具有突出的T的线性质粒，其特征在于，
所述双向表达T载体的第一末端设置有第一强启动子和第二终止子，所述第一强启动子的方向朝向所述第一末端的方向，所述第二终止子位于所述第一强启动子的上游；
所述双向表达T载体的第二末端设置有第二强启动子和第一终止子，所述第二强启动子的方向朝向所述第二末端的方向，所述第一终止子位于所述第二强启动子的上游。
2.根据权利要求1所述的双向表达T载体，其特征在于，所述第一强启动子为T7启动子，所说第一终止子为T7终止子。
3.根据权利要求1所述的双向表达T载体，其特征在于，所述第二强启动子为热激启动子，所说第二终止子为热激终止子。
4.根据权利要求1所述的双向表达T载体，其特征在于，还包括筛选标记。
5.根据权利要求4所述的双向表达T载体，其特征在于，所述筛选标记为抗性筛选标记。
6.根据权利要求5所述的双向表达T载体，其特征在于，所述筛选标记为氨苄抗性基因表达框。
7.一种制备权利要求1-6中任一项所述的双向表达T载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：使用pET20b为起始质粒，改造pET20b质粒，保留pET20b上的复制起始子、氨苄抗性基因表达框、T7启动子和T7终止子；
S2：在T7启动子与T7终止子之间插入热激启动子，热激启动子的方向与T7启动子相反，并在T7启动子的上游插入T7终止子；
S3：在T7启动子与热激启动子之间切开，并使产生的两个末端带有突出的3’T。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，S1中移除pET20b中的原有BciV I位点；
S3中，在两个启动子之前插入两个方向相反的BciV I位点，然后通过BciV I酶切，得到具有突出的3’T的两个末端。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，通过在两个启动子之间切出平末端切口，然后在仅含有dTTP的Taq酶PCR扩增体系中72℃处理5-10分钟，使所述平末端带有突出的3’T。
10.权利要求1-6中任一项所述的双向表达T载体在分子克隆中的应用。
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