[发明专利]一种莫氏巴贝斯虫检测试剂盒

说明书

本发明公开一种利用交叉引物恒温扩增结合免疫层析技术检测和鉴别莫氏巴贝斯虫的试剂盒与使用方法。本发明的莫氏巴贝斯虫检测试剂盒中包括有用于恒温扩增的五条引物，其中：序列为SEQ ID No.3的一条交叉引物、序列为SEQ ID No.1和序列为SEQ ID No.2的置换引物、序列SEQ ID No.4为FITC标记的探针引物和序列为SEQ ID No.5的生物素标记的探针引物。试剂盒还包括有免疫层析试纸条。本发明具有：操作简便、快速、灵敏度高、特异性高、使用范围广和检测结果可用肉眼读取的优点。

技术领域

本发明涉及一种非疾病诊断为目的的，用于检测和鉴别动物是否带有病原寄生虫的方法与试剂盒，确切讲本发明涉及一种利用交叉引物恒温扩增结合免疫层析技术检测和鉴别莫氏巴贝斯虫的方法与试剂盒。

背景技术

羊的巴贝斯虫病(Ovis Babesiosis)是一种由媒介蜱传播的寄生于绵和山羊的红细胞内引起的血液原虫病，感染动物表现为发热、黄疸、血红蛋白尿，严重感染时会引起动物死亡(Uilenberg,2006)。全世界报道的引起羊巴贝斯虫病的病原有莫氏巴贝斯虫(Babesia motasi)、绵羊巴贝斯虫(Babesia ovis)、粗糙巴贝斯虫(Babesia crassa)、叶状巴贝斯虫(Babesiafoliata)和泰氏巴贝斯虫(Babesia taylori)。在我国流行的巴贝斯虫有两个种，即莫氏巴贝斯虫和巴贝斯虫未定种新疆株(Guan et al.,2002,2009；Liu etal.,2007；Niu et al.,2009)。利用ITS、HSP90、COI、COB、COX3、RPS8、TRAP、AMA1、RON2等基因对我国的巴贝斯虫分离株进行分类研究表明，莫氏巴贝斯虫被分成两个小分支，即河北株/宁县株(莫氏巴贝斯虫HN亚种)和临潭株/天祝株(莫氏巴贝斯虫LT亚种)(Bai et al.,2002；Guan et al.,2002；Liu et al.,2007b；Niu et al.,2009a)。

羊的巴贝斯虫病在我国流行范围广，危害严重，对我国养羊业的健康持续发展造成了巨大的威胁。关贵全等和王锦明等分别利用以莫氏巴贝斯虫LT亚种和巴贝斯虫未定种裂殖子可溶性抗原建立的间接ELISA方法，对我国22个省份羊巴贝斯虫病的流行状况调查显示，莫氏巴贝斯虫的平均阳性率为43.5％，羊巴贝斯虫未定种为31.66％，该病在全国范围内均有流行(Guan et al,2012；Wang et al,2013)。

目前用于羊巴贝斯虫感染检测的方法有经典的血涂片染色法，该方法在染虫率很低的情况下难以检出病原，而且对操作人员的技能要求较高。基于分子生物学开发的巴贝斯虫鉴别检测方法有实时荧光定量PCR、反向线性印迹、多重PCR等，这些方法灵敏度高、特异性也较高，但是实时荧光定量PCR和多重PCR需要昂贵的仪器；反向线性印迹操作繁琐、耗时长。而且上述方法不利于现场快速检测的应用。因此，亟待开发一种快速、高灵敏度和特异性的可用于临床现场检测的可靠方法。

发明内容

本发提供一种可克服现有技术不足，用于莫氏巴贝斯虫鉴别检测的交叉引物恒温扩增联合免疫层析试纸检测的方法及试剂盒。

本发明的莫氏巴贝斯虫检测试剂盒中包括有用于恒温扩增的五条引物：序列为SEQ ID No.3的一条交叉引物、序列为SEQ ID No.1和序列为SEQ ID No.2的置换引物、FITC标记的探针引物SEQ ID No.4和生物素标记的探针引物SEQ IDNo.5。试剂盒还包括有免疫层析试纸条。

优选地，为方便使用，本发明的莫氏巴贝斯虫检测试剂盒中还包括：10×IsothermalAmplification Buffer、100mM MgSO₄、2.5mM dNTP mix，Bst DNA聚合酶。