[发明专利]耐热性提高的羰基还原酶突变体

说明书

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体是以理性设计的方案，利用consensus方法以及FirePort在线网站识别了4个与羰基还原酶ChKRED03热稳定性相关的位点，并将有益突变位点进行整合，获得热稳定性大幅度提高的组合突变体。这些耐热性提高的突变体更利于工业应用。

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体内容涉及耐热性提高的羰基还原酶突变体。

背景技术

作为氧化还原酶家族的一员，羰基还原酶(Carbonyl reductase，EC 1.1.1.184)能够催化羰基的不对称还原生成相应的手性醇。手性醇是一类重要的有机合成砌块，在医药、农业、食品和化工等行业都有很高的应用价值。利用羰基还原酶生物催化生产手性醇越来越广泛地应用于工业生产中。

为了适应极端工业环境下的应用，如极端温度、强酸碱环境等，对羰基还原酶的酶学性能提出了更高的要求，理想条件是酶能够在这些环境下保持良好的活力和稳定性。其中酶的热稳定性是工业应用的重要指标。高温条件下，酶的催化效率高，反应周期短，可以有效地提高时空产率，节约成本，且便于操作，也有利于避免反应过程中被其他微生物污染。

分子改造技术为研究酶的底物特异性和催化活性位点、改善酶的热稳定性以及提高酶作用温度等提供了有效手段。通过分子改造，可以快速定向地获得符合工业需求的酶。定向进化和理性/半理性设计是酶分子改造的主要技术手段，也是当前酶工程领域研究的热点。目前，已有许多学者运用这项技术成功的改造了各种各样的酶，取得了令人瞩目的进展(C.A.Denard,H.Ren and H.Zhao,Curr Opin Chem Biol,2015,25,55-64.)。其中，定点突变技术已成为酶分子改造中常用的手段，大大加速了蛋白质的进化过程(H.Yang,J.Li,H.D.Shin,G.Du,L.Liu and J.Chen,Appl Microbiol Biotechnol,2014,98,23-29.)。

发明内容

本发明以理性设计的方案，利用consensus方法以及FirePort在线网站预测来源于金黄杆菌CA49(Chryseobacterium sp.CA49)的羰基还原酶ChKRED03(氨基酸序列为SEQID NO.2)热稳定性相关的氨基酸位点，并进行分子改造，利用定点突变技术进行单点突变和组合突变，从而获得热稳定性提高的突变体。

所述羰基还原酶突变体是以SEQ ID NO.2为出发序列，将第183位的苏氨酸突变为缬氨酸，或者将第183位的苏氨酸突变为异亮氨酸，或者将第188位的天冬酰胺突变为亮氨酸，或者将第211位的丙氨酸突变为脯氨酸，或者将第224位的丝氨酸突变为辅氨酸，或者以上四个位点的任意组合得到的突变体。

根据本领域公共知识，构建的能表达上述突变体的载体、基因工程菌等也属于本发明的保护范围。

为了达到以上目的，本发明根据理性设计预测得到的氨基酸位点，以定点突变技术对母本羰基还原酶ChKRED03基因进行突变，获得5个热稳定性提高的单点突变体。以定点突变技术将单点突变体进行多位点整合，获得3个耐热性进一步提高的组合突变体。

本发明的具体技术方案为：