[发明专利]一种CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种CAGW多肽和TAT‑NLS多肽修饰的载基因复合物及其制备方法和应用，制备方法包括：制备聚乙二醇‑聚乙丙交酯共聚物mPEG‑b‑PLGA；制备聚乙丙交酯‑g‑聚乙烯亚胺共聚物PLGA‑g‑PEI；以PLGA‑g‑PEI为原料制备PLGA‑g‑PEI‑g‑CAGW共聚物；将PLGA‑g‑PEI‑g‑CAGW和mPEG‑b‑PLGA自组装制备靶向共聚胶束；向靶向共聚胶束中加入pDNA和TAT‑NLS，制得载基因复合物。本发明制得的载基因复合物对细胞有特异选择性，且具有很好的穿透能力和进核能力，且转染效率较高。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种CAGW多肽和TAT-NLS多 肽修饰的载基因复合物及其制备方法和应用。

背景技术

心血管疾病是由于内皮功能紊乱或损伤而发生，因此重建或修复血管内皮层 对心血管疾病的治疗是一个有效的策略。许多研究将ECs细胞培养后种植在内 皮层损伤的血管上，从而达到改善和修复内皮功能的目的。Wilson等用重组逆 转录病毒将LacZ基因导入犬内皮细胞。细胞经LacZ基因转染后，种植在人造 血管上植入犬大颈动脉，五周后扫描电镜结果证实内皮细胞完全包覆血管腔面。 虽然ECs再生性强又位于血管内侧，基因表达产物可经血液循环分布全身。但 是内皮细胞作为心血管疾病基因治疗中较理想的靶细胞，其固有的对外源基因 的抑制以及对毒性的高敏感，被认为是较难转染的细胞之一。基因治疗技术的 成功应用很大程度上取决于载体的发展，因此合成安全、高效的基因递送载体， 是实现基因治疗应用于临床的首要前提。

在过去几十年，阳离子聚合物这类基因载体具有安全性相对较好、可多次利 用、制备过程较简单、易于修饰等优点。然而，由于其细胞毒性不耐受及较低 的转染效率，使得阳离子聚合物的应用受到极大的限制。本课题组以前的研究 中设计不同的可生物降解的阳离子聚合物作为基因载体，递送pEGFP-ZNF580 (pDNA)质粒转染内皮细胞，以达到人工血管快速内皮化的目的。我们的研究 结果证明不同的以聚乙烯亚胺(PEI)为基本结构的基因载体可以不同程度的促 进内皮细胞增殖和迁移，但仍然存在转染效率低、细胞毒性较大的缺点。虽然 靶向多肽(REDV、CAG)修饰后对ECs的转染效率有提高的表现。但依然存 在载体进细胞困难；内涵体/溶酶体逃逸困难；以及pDNA进入细胞核较难的问 题。

TAT多肽(Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg)因富含精氨酸片 段而带有正电荷，可携载pDNA直接通过跨细胞膜进入细胞，且对细胞膜无损 伤。核定位信号NLS(Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val)是通过核膜上的核孔复合 物(NPC)转运小分子物质(40-60kDa)进入细胞核。有研究证实NLS修饰 PEI(1.8kDa)携带基因可以提升载体对细胞的转染效率。但是TAT和NLS在单独 使用时都不能达到令人满意的转染效率。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种CAGW多肽和TAT-NLS 多肽修饰的载基因复合物及其制备方法和应用，可有效提高现有的载基因复合 物进入细胞困难和转染效率低的问题。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物，其制备方法包括 以下步骤：

(1)采用mPEG作为大分子引发剂，辛酸亚锡作为催化剂，引发DL-LA 和GA开环共聚，制得聚乙二醇-聚乙丙交酯共聚物mPEG-b-PLGA；

(2)采用山梨醇作为引发剂，Sn(Oct)₂甲苯溶液作为催化剂，引发DL-LA 和GA开环共聚，制得聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA，然后将其羧基化后与PEI 进行接枝反应，制得乳酸-羟基乙酸-g-聚乙烯亚胺共聚物PLGA-g-PEI；