[发明专利]一种大肠杆菌β半乳糖苷酶受体的原核表达载体

说明书

本申请涉及一种大肠杆菌β半乳糖苷酶受体的原核表达载体。本申请提供了一种SEQ ID NO：1所示的编码β半乳糖苷酶受体的核苷酸，以及SEQ ID NO：2所示的β半乳糖苷酶受体。根据大肠杆菌β半乳糖苷酶结构和功能，以及酶供体和酶受体的互补原理，设计了删除第13至33位氨基酸的酶受体；将酶受体的编码核苷酸与载体连接，并转化至大肠杆菌构建重组表达宿主细胞；通过发酵大量表达酶受体；通过亲和层析技术对酶受体纯化，脱盐后的酶受体纯度在90％以上。与常规酶受体相比，本申请的酶受体产量更高、互补活性更强，可应用于CEDIA生化诊断试剂的研制。

本申请是申请号为201610841474.8，申请日为2016年9月22日，发明名称为“一种大肠杆菌β半乳糖苷酶受体及其制备方法”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本申请涉及生物技术领域，更具体地涉及克隆酶供体免疫分析技术。本申请提供了一种大肠杆菌β半乳糖苷酶的酶受体，其编码核酸、表达载体、宿主细胞及制备方法。

背景技术

大肠杆菌β半乳糖苷酶(GenBank:EDU66561.1)可以通过溴化氢CNBr₂裂解或者基因重组技术得到两个肽段：缺失N端少量氨基酸的大片段，称为酶受体(Enzyme acceptor，EA)：缺失大部分C端氨基酸的小片段，称为酶供体(Enzyme donor，ED)。二者单独存在没有酶活性，同时存在时二者可以聚合，形成具有酶活性的全酶，这一现象被定义为α-互补。

大肠杆菌β半乳糖苷酶的这种特性已被应用于分子生物学和克隆酶供体免疫分析技术(Cloned Enzyme Donor Immunoassay，CEDIA)中。CEDIA技术在临床生化诊断中可以检测小分子化合物。

CEDIA是一种免疫检测技术，其结合了β半乳糖苷酶α互补原理和抗原抗体的特异性结合性质。将小分子抗原(Ag)与ED偶联，形成ED-Ag偶联物，此偶联物能与EA自发结合，形成有活性的β半乳糖苷酶。但是，如果在反应体系中加入针对该小分子抗原的抗体(Ab)，抗原抗体的特异性结合会形成ED-Ag-Ab复合物。此时，由于抗体空间位阻的影响，ED-Ag-Ab复合物不能再与EA结合形成具有活性的β半乳糖苷酶。如果样本中含有待检测的小分子抗原，此时反应体系中含有两种形式的抗原：一种是样本中的游离Ag；一种是试剂盒中的ED-Ag。这两种抗原都具有与抗体特异性结合的能力。显然，这两种形式的抗原会竞争性的结合反应体系中的Ab，样本中游离Ag越多，其结合的Ab就越多，从而导致有更多的剩余ED-Ag偶联物(未与抗体结合的部分)能与EA自发结合，形成具有活性的β半乳糖苷酶，且酶活性的高低与样本中游离抗原的含量成正比。

大肠杆菌β半乳糖苷酶EA可以应用于CEDIA技术临床生化诊断试剂的研制，是一种重要的原料酶，具有较大应用价值。

目前报道的经基因工程改造过的EA或者EA突变体有多种，例如在Langley KE和Zabin I发表的论文中(Biochemistry.1976Nov 2；15(22):4866-75)提到了一种β半乳糖苷酶，和野生型EA相比，其缺失第11至41位的氨基酸残基(被称为M15)。

再比如，缺失23至31位氨基酸的M112；缺失35至52位氨基酸的EA5；缺失30至37位氨基酸的EA14；缺失35至54位氨基酸的EA11；缺失21至53位氨基酸的EA17；缺失13至45位氨基酸的EA18；缺失26至45位氨基酸的EA20；缺失13至40位氨基酸的EA22；缺失16至35位氨基酸的EA23；缺失22至35位氨基酸的EA24(Daniel R.Henderson,Clinical Chemistry,Vol.32,No.9,1986,1637-1641)。国内还有学者报道同时缺失1至5和14至40位氨基酸的β-半乳糖苷酶EA(大肠杆菌β-半乳糖苷酶EA、ED融合蛋白的表达；中华微生物学和免疫学杂志，2003,23,No 2:113-114)。

表1.现已报道的EA突变体总结