[发明专利]一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法

权利要求书

1.一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）起始细胞的来源和准备

起始培养的细胞来源使用非动员药物处理的正常外周血，将获得的血液制品，用淋巴细胞分离液或者利用红细胞裂解液去除红细胞，获得的单个核细胞用不含钙离子和镁离子的磷酸盐缓冲液进行洗涤2-3次，备用；

（2）异质性造血干祖细胞克隆的捕获和制备

将上述获得的单个核细胞用细胞培养材料水凝胶进行包裹并种植，称之为胶囊状培养体系，用10%蔗糖溶液洗涤一次，20%蔗糖重悬，种植在孔板中，用培养液进行培养，每2-3天更换培养液，出现不同形态的克隆；培养液由20-150 ng/ml干细胞生长因子SCF、20-150ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体抗体、20-100 ng/ml血小板生成素TPO、10-50 ng/ml白介素6IL6、10-50 ng/ml白介素3 IL3、2-10 ng/ml血管生长因子VEGF、10-20 ug/ml维生素C、嘌呤霉素衍生物StemRegenin1组成；

（3）单细胞测序技术检测造血干祖细胞克隆的异质性

根据形态特征，挑选克隆中的单个细胞，进行单细胞测序，提取单细胞RNA，用带有Oligo的磁珠富集真核生物mRNA，以打断后的mRNA为模板合成cDNA，试剂盒纯化回收，PCR扩增建库，构建好的文库测序，检测单细胞测序转录表达情况，根据基因测序获得的reads数，分析基因表达、基因结构优化、可变剪接、新转录本预测及注释、SNP检测，并从基因表达结果中，筛选出样品间差异表达的基因；

（4）异质性造血干祖细胞克隆的表面分子表达

胶囊状培养体系中各种克隆长至每个克隆包含30-80个细胞，将体系打散，混合，用乙二胺四乙酸消化液进行消化，过70um网筛，离心，收获细胞，获得的细胞利用流式细胞仪技术检测造血干祖细胞表面分子表达的情况，包括CD34、CD43、CD45、CD90；

（5）体外分化潜能检测

对胶囊状培养体系中出现的几种不同形态克隆，根据克隆形状进行挑选，每种克隆挑选200-300个细胞，于含有生长因子的甲基纤维素半固体培养基进行克隆形成实验，检测不同克隆的多向分化潜能，包括瀑式红系集落，一般小的红系集落，粒系细胞集落，粒系-巨噬细胞集落，红系-粒系-巨噬混合细胞集落；

（6）不同克隆的生长潜能检测

对胶囊状培养体系中出现的几种细胞类型克隆，包括致密型克隆，血管状克隆，铺路石状克隆，自由分散型克隆，根据克隆形状进行挑选，将不同的克隆单独挑出，于含有造血干祖细胞生长因子的培养基中进行生长潜能研究验，检测不同克隆的自我更新潜能；

（7）胶囊状培养体系中造血干细胞转录因子表达的检测

胶囊状细胞培养体系整体细胞群体在分子水平的生物学特征研究，利用RNA测序的方式检测胶囊状培养体系中的细胞在转录组水平的变化，特别是造血干细胞相关的转录因子、信号通路和与微环境相关因子；

（8）整个胶囊状细胞培养体系整体细胞群体体内造血分化潜能的检测，各种造血集落打散后形成的细胞群体，进行移植实验，检测细胞体内长期自我更新和多向分化潜能，定期检测小鼠体内人源化细胞的植入情况，以同等条件下非胶囊状细胞培养的细胞作为对照。

2.根据权利要求1所述的一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法，其特征在于，步骤（2）中经培养，出现不同形态的克隆包括致密型克隆，血管状克隆，铺路石状克隆，自由分散型克隆。

3.根据权利要求1所述的一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法，其特征在于，步骤（3）中，基于差异表达基因，进行GO功能显著性富集分析和pathway显著性富集分析，对单细胞进行主成份的细胞聚类分析，以检测上述各种克隆的异质性。

4.根据权利要求1所述的一种利用非动员外周血制备异质性造血干祖细胞的方法，其特征在于，步骤（7）中转录因子包括CD34，Runx1，GATA2，c-MYC，HoxA9，HoxB4， GATA1，Tie2；信号通路主要有造血干细胞干性维持、代谢、分化通路基因；微环境相关因子主要为归巢、细胞粘附相关因子。