[发明专利]利用CRISPR/Cas9系统生产VEGF164转基因细胞系的方法

说明书

本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9系统生产VEGF164转基因细胞系的方法，步骤如下：构建针对毛囊特异启动子KAP6.1的3’UTR区的同源打靶载体PB‑G‑H‑VEGF164‑DsRed；设计并合成针对KAP6.1的3’UTR区的CRISPR/Cas9系统切割位点的sgRNA，将合成的sgRNA克隆入pGL3‑U6‑sgRNA‑PGK‑puromycin构成sgRNA转录载体；将同源打靶载体、sgRNA转录载体及Cas9表达载体混合，转染绒山羊胎儿成纤维细胞，经过筛选后获得的阳性绒山羊胎儿成纤维细胞。本发明解决了纯合个体较难获得，基因插入效率较低的问题。

技术领域

本发明属于动物基因工程和遗传修饰领域，具体地说，涉及一种利用CRISPR/Cas9系统生产VEGF164转基因细胞系的方法，尤其是涉及一种利用CRISPR/Cas9系统生产用于体细胞核移植的VEGF164转基因细胞系的方法。

背景技术

CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌内通过RNA介导的特异性切割外源遗传物质的获得性免疫系统。II型CRISPR/Cas系统即CRISPR/Cas9已经被证明可以广泛的用于体内、体外任意给定的DNA的高效切割，同时也有部分研究表明了该系统可以用于基因组的定点突变和定点插入。CRISPR/Cas9与传统的ZFN和TALEN技术相比效率高、序列选择限制小、构建过程简单、可同时靶向多个基因等优点。而CRISPR/Cas9最大的缺点就是它的脱靶效应，目前多个研究表明这种脱靶效应可以通过一定的技术手段控制，所以目前该系统仍是最主流的基因编辑系统。

传统的育种方法存在着育种进展缓慢、育种年限长、一次可选择的性状数量有限等缺点，分子标记辅助选择的方法理论发展迅速实践应用困难，因此转基因育种技术与传统育种技术的结合显得尤为重要。VEGF基因可以通过促进毛乳头细胞的生长，进而起到促进动物毛发生长的作用。为了提高绒山羊的绒产量，进一步研究绒山羊毛囊发育相关基因，针对促进毛囊发育生长的基因进行基因敲入试验。通过CRISPR/Cas9系统对山羊基因组中影响产绒性状的VEGF164基因定点敲入至绒山羊细胞，获得用于体细胞核移植的VEGF164转基因细胞系，对我国畜牧业的长足发展具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明针对转基因技术中存在的纯合个体较难获得，基因插入效率较低的问题，提供了一种利用CRISPR/Cas9系统生产VEGF164转基因细胞系的方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9系统生产VEGF164转基因细胞系的方法，包括以下步骤：

S1.构建针对毛囊特异启动子KAP6.1的3’UTR区的同源打靶载体PB-G-H-VEGF164-DsRed；

S2.设计并合成针对KAP6.1的3’UTR区的CRISPR/Cas9系统切割位点的sgRNA，将合成的sgRNA克隆入pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin构成sgRNA转录载体；

S3.将以上步骤的同源打靶载体、sgRNA转录载体及Cas9表达载体混合，利用3000转染绒山羊胎儿成纤维细胞，经过筛选后获得的阳性绒山羊胎儿成纤维细胞即为用于生产体细胞核移植的VEGF164转基因细胞系。

可选地，步骤S1中构建同源打靶载体PB-G-H-VEGF164-DsRed具体为：选择山羊基因组中KAP6.1基因3’UTR区域序列作为同源臂，左同源臂为包含除去终止密码子的KAP6.1基因CDS左侧序列，右同源臂为包含KAP6.1基因3’UTR的右侧序列，以此实现外源基因靶向敲入KAP6.1基因3’UTR区并和KAP6.1基因共表达；以VEGF164作为外源基因，选择DsRed及BGH polyA终止子串联作为外源基因表达盒，以EF1启动的GFP和Puro作为筛选标记基因，构成的同源打靶载体命名为PB-G-H-VEGF164-DsRed。