[发明专利]细胞表型图像定量分析的高通量功能基因筛选方法及系统

权利要求书

1.一种细胞表型图像定量分析的高通量功能基因筛选方法，其特征在于，含有以下步骤：

(1)导入GFP-Atg8进入酵母细胞其表达并产生绿色荧光，利用FM4-64标记液泡，使其产生红色荧光，表型产生条件有减氮以及雷帕霉素诱导；细胞0小时为无自噬表型细胞，在减氮条件下，2小时后细胞发生自噬；利用全自动荧光显微镜拍取得到有细胞自噬表型的细胞图像和无细胞自噬表型的细胞图像；所述有细胞自噬表型的细胞图像和无细胞自噬表型的细胞图像中均具有荧光标记，所述荧光标记用于识别有细胞自噬表型的细胞图像中的细胞自噬表型，以及区分无细胞自噬表型的细胞图像中不具有细胞自噬表型；

(2)将步骤(1)所述的有细胞自噬表型的细胞图像和无细胞自噬表型的细胞图像分别转化成有细胞自噬表型的黑白二值图像和无细胞自噬表型的黑白二值图像；所述黑白二值图像中细胞区域为白色，细胞区域以外为黑色；

(3)将步骤(2)中所述的有细胞自噬表型的黑白二值图像分割成包含单个有细胞自噬表型细胞的图像，将步骤(2)中无细胞自噬表型的黑白二值图像分割成包含单个无细胞自噬表型细胞的图像；

(4)将步骤(3)所述包含单个有细胞自噬表型细胞的图像中的细胞区域在步骤(1)所述的有细胞自噬表型的细胞图像中对应的细胞区域作为阳性训练集，将步骤(3)中包含单个无细胞自噬表型细胞的图像中的细胞区域在步骤(1)中的无细胞自噬表型的细胞图像中对应的细胞区域作为阴性训练集；

利用VGG16作为预训练模型，增加全局平均池化层，增加全连接层，softmax激活函数用作分类，组合预训练模型与新加层；训练新加层，冻结VGG16所有层，用细胞图片在原模型基础上进行迁移学习得到最终模型；

(5)将基因敲除的细胞利用导入GFP-Atg8，FM4-64标记液泡产生绿色和红色荧光，置入减氮培养基，依次注入96孔板的不同的孔内，将96孔板置于全自动荧光显微镜的载物台上准备拍照；显微镜依次扫描96孔板，生成大量细胞表型图像，平均每秒产生一张图像，每张图像500细胞左右；

(6)利用步骤(4)得到的最终模型对步骤(5)得到的图像进行表型定量，FMP48、SWE1、FUS3和CTK-N敲除1h后自噬细胞与未自噬细胞比分别为38％，35％，26％和15％，说明FMP48、SWE1、FUS3和CTK-N敲除对细胞自噬产生影响，其中自噬越少的CTK-N敲除对自噬的影响最大。

2.如权利要求1所述的细胞表型图像定量分析的高通量功能基因筛选方法，其特征在于，步骤(3)中所述分割成包含单个有细胞自噬表型细胞的图像，含有以下步骤：

S1：所述包含单个有细胞自噬表型细胞的图像中细胞区块的加权质心的横坐标和纵坐标分别由以下公式计算：

其中，m为单个白色区块中像素点个数；x_i和y_i分别是所述单个白色区块中像素点i的横坐标和纵坐标；f(x_i,y_i)为所述单个白色区块中像素点i的像素值；将所述单个白色区块中水平方向最多的白色像素点个数作为水平方向的直径，将该白色区块中垂直方向最多的白色像素点的个数作为垂直方向的直径；如果x大于等于水平方向的直径和/或y大于等于垂直方向的直径，这舍弃该白色区块；如果x小于水平方向直径且y小于垂直方向的直径，则保留该白色区块；

S2：将步骤S1中保留的白色区块的加权质心作为圆心，以所述圆心周围的黑白交界点为轮廓点，去除在白色区块轮廓之外的白色像素点，剩余的部分则为包含单个有细胞自噬表型细胞的图像。

3.如权利要求1所述的细胞表型图像定量分析的高通量功能基因筛选方法，其特征在于，步骤(2)中利用腐蚀算法去除所述二值图像的噪点，并利用膨胀算法连接所述二值图像中细胞的破损区域。

4.如权利要求1所述的细胞表型图像定量分析的高通量功能基因筛选方法，其特征在于，步骤(2)采用Otsu阀值法处理有细胞自噬表型的细胞图像和无细胞自噬表型的细胞图像，使所述有细胞自噬表型的细胞图像和无细胞自噬表型的细胞图像分别转化成有细胞自噬表型的黑白二值图像和无细胞自噬表型的黑白二值图像。