[发明专利]基于小鼠小肠类器官的食物功效成分对小肠生长特性影响的快速评价方法

权利要求书

1.一种基于小鼠小肠类器官的食物功效成分对小肠生长特性影响的快速评价方法，其特征在于包括以下几个步骤：

步骤一、培养3代以上冻存小肠类器官复苏后，24孔培养板1中培养4-5天，去除完全培养基，在24孔培养板1的每孔中加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上，用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎，得到复合凝胶悬液1；用注射器吸取全部复合凝胶悬液1后推出，重复一次，使隐窝类似结构从小肠类器官中释放，得到解离小肠类器官悬液1；将解离小肠类器官悬液1转移至15毫升离心管1中，以200g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管1中上清液；向含有解离小肠类器官悬液1的离心管1中加入150-200微升冰上预融化的复合凝胶液，用移液枪吹打3-4次制成冰上预融化的复合凝胶悬液2；将复合凝胶悬液2按照每孔5微升体积接种于37℃预热96孔培养板1中，每孔小肠类器官密度为30-80个/孔；将96孔培养板1置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向96孔培养板1的孔中加入120微升含特定浓度食物成分的完全培养基，不含食物成分的完全培养基作为对照，随后每2天更换一次相应培养基；

步骤二、步骤一中，类器官接种于96孔板1两小时后，4倍显微镜全景记录类器官状态，培养24小时后4倍显微镜再次全景记录类器官状态，随后培养5-6天后，再次4倍显微镜再次全景记录类器官状态；

步骤三、分析步骤二中的接种2小时、24小时和5-6天后小肠类器官特征参数，包括：记录培养2小时96孔板1中每孔单个类隐窝或囊状结构个数，记为参数a；记录培养24小时96孔板1中囊形结构表面积，记为参数b；记录培养5-6天与培养24小时记录相对应小肠类器官表面积，记为参数c；记录培养5-6天与培养2h相对应每个小肠类器官形成芽体个数，然后求和得参数d；记录培养5-6天与培养2h相对应形成典型多芽体类器官个数，记为参数e；

步骤四、根据步骤三中获得类器官生长特征参数a，b，c，d和e，获得小肠类器官生长表型参数1：类器官形成率＝e/a，表征肠道类器官存活率；参数2：类器官扩增率＝c/b，表征肠道干细胞分化能力；参数3：单个类器官出芽率＝d/统计类器官个数，表征肠道类器官增殖及分化能力。

2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于所述完全培养基由5％R-spondin条件培养基、10％Noggin条件培养基、85％DMEM/F12培养基、1mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、2.5mML-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、50ng/ml表皮生长因子、1X神经元细胞培养补充剂N2和B27、10μM Rho相关形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶卷曲螺旋抑制剂Y27632组成。

3.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于所述复合凝胶液提取自小鼠肉瘤，由粘连蛋白、胶原蛋白IV、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、转化生长因子-β、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、成纤维细胞生长因子和组织纤溶酶原激活剂组成。