[发明专利]一种免疫定量检测方法和应用

说明书

本发明公开了一种免疫定量检测方法，包括以下步骤：步骤S1、通过标准品和拮抗剂建立竞争指数‑浓度的标准曲线方程；步骤S2、检测样品的竞争指数，根据样品的竞争指数利用标准曲线方程来计算样品中待测抗原的浓度。本发明的免疫定量检测方法通引入特殊设计抗原(拮抗剂)把样本和标准品的免疫反应建立关联，再通过双色荧光反应把荧光强度数据处理成为竞争指数，建立剂量‑竞争指数的标准曲线来定量；采用竞争指数作为定量的反应关系，不仅解决了免疫反应条件差异的影响，又能使用存储的标准曲线进行定量，不用每次随样本做标准曲线，完美解决了免疫分析(包括免疫层析)准确定量与简单方便之间的矛盾。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种免疫定量检测方法和应用。

背景技术

免疫检测的定量方案有两种：制作标准曲线定量和相对比较的半定量。标准曲线一般是在其检测的线性范围内，由多个(五个或更多)已知浓度的标准品同步与样本反应，根据其剂量-反应关系确定，连接这些点并拟合生成标准曲线，再根据样本的反应值来计算其浓度，这种方法具有定量准确的优点，但需要同时检测多个浓度的标准品来制作标准曲线，一般用在ELISA、化学发光免疫检测等同时能进行多样本检测的技术中。半定量免疫检测是通过比较样本反应的程度与标准浓度(一般只有一个)的反应程度来大致确定样本浓度，常用于单个测试中，具有简单方便的优点，但定量误差大、准确度低。

但是，无论是标准曲线法还是半定量法，标准品与样本之间都是各自反应，两者反应的关联度不强，无论哪一方发生问题都会影响最终定量结果的准确性。

发明内容

本发明提供一种免疫定量检测方法和应用以实现快速准确的免疫定量检测。

一方面，本发明提供一种免疫定量检测方法，包括以下步骤：

步骤S1、通过标准品和拮抗剂建立竞争指数-浓度的标准曲线方程；

步骤S2、检测样品的竞争指数，根据所述样品的竞争指数利用所述标准曲线方程来计算样品中待测抗原的浓度。

在本发明提供的免疫定量检测方法中，所述标准品中的抗原和所述样品中的待测抗原包含第一抗体识别位点和第二抗体识别位点，不含第三抗体识别位点；所述拮抗剂为包含第一抗体识别位点和第三抗体识别位点、不含第二抗体识别位点的抗原；使用第一荧光物质标记所述第二抗体，使用第二荧光物质标记所述第三抗体。

在本发明提供的免疫定量检测方法中，所述第三抗体可识别基因工程抗原标签蛋白(包含且不限于MyC、His、GST、HA、GFP、CFP、YFP、荧光素酶等)或其他的位点，不能识别所述标准品中的抗原和所述样品中的待测抗原上的位点。

在本发明提供的免疫定量检测方法中，可以使用特异反应的结合物和配体(包含且不限于亲和素与生物素、酶与底物、受体与配体、蛋白质与适配体等)来代替所述第三抗体及其抗原位点。

在本发明提供的免疫定量检测方法中，所述步骤S1包括：

步骤S11、将所述标准品与所述拮抗剂的混合物与标记物液体反应，去除未反应的液体；

步骤S12、检测所述第一荧光物质和所述第二荧光物质的荧光强度，计算竞争指数，所述竞争指数＝所述第一荧光物质的荧光强度/所述第二荧光物质的荧光强度；

步骤S13、改变所述标准品的浓度，重复步骤S11和步骤S12，得到对应的竞争指数；

步骤S14、利用标准品的浓度和对应的竞争指数绘制所述标准曲线方程。

在本发明提供的免疫定量检测方法中，所述步骤S2包括：

步骤S21、将所述样品与所述拮抗剂的混合物与标记物液体反应，去除未反应的液体；

步骤S22、检测所述第一荧光物质和所述第二荧光物质的荧光强度，计算竞争指数；