[发明专利]蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法及应用

说明书

本发明公开了一种蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法及应用。该方法是利用正向‑反向同位素标记的定量方法结合蛋白热稳定变化测量技术，其能够通过观测细胞内部哪些蛋白在药物的包裹下发生热力学变化，全局性地鉴定与药物相互作用的靶标蛋白。本发明的方法克服了传统鉴定方法的假阳性率高的缺点，其具有高通量、高深度、高精度、检测范围广，耗时短的特点，打破现有技术在药物靶标鉴定方面的局限性，为药物靶标研究提供有力的支撑。

技术领域

本发明属于药物靶标蛋白筛选领域，特别涉及一种蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法及应用。

背景技术

小分子药物在生理状态下特异性与靶标蛋白结合(Drug Target Interaction)是成功治疗疾病的关键。鉴定药物的特异性靶标蛋白，分析药物的分子机理是贯穿药物研发各个阶段的重要任务，也是药物临床前研究的核心内容。然而，在生理条件下，单一小分子药物在体内可能存在多个靶标蛋白，因此全面鉴定小分子药物的结合蛋白有助于药物临床应用的推广及其副作用评估。

鉴定小分子药物与靶标蛋白相互作用是药物研发的核心问题，传统的鉴定方法主要有亲和层析技术、生物素化探针技术^[1,2](如依赖于生物素的蛋白富集及质谱鉴定：利用生物素(biotin)连接小分子药物，对靶标蛋白进行富集及质谱鉴定分析)，放射性标记或者荧光探针法^[3]、依赖于计算机的分子模拟对接等^[4]。虽然这些方法都在一定程度上取得进展，但这些传统的方法局限性在于操作繁琐，耗时，假阳性高，仍是药物开发领域的瓶颈。因此，高效、高准确性、高通量的鉴定药物-蛋白相互作用技术仍需进一步开发。

蛋白热稳定变化测量技术能够很大程度弥补传统技术的缺陷。早在2002年，研究发现药物与蛋白结合能够提高蛋白的热稳定性^[5]，在此基础上人们开发了蛋白热稳定性测量方法^[6]。这技术最早应用于检测某一小分子化合物与特定蛋白是否存在直接相互结合的。近几年来，高通量技术的引入为该项技术带来新的血液，特别是在针对已知蛋白寻找特异结合的小分子化合物方面，已经有科研团队利用该技术从小分子化合物库中高通量(384孔板)筛选特异靶向该蛋白的小分子抑制剂^[7]。目前，针对某小分子药物寻找其靶标蛋白的最好方法是将蛋白热稳定变化测量技术与高通量质谱联用。然而，在众多质谱定量方法中，最为稳健、精确的方法是SILAC(stable isotope labeling with amino acids in cellculture)标记定量蛋白质组学技术。

SILAC标记定量蛋白质组学技术凭借其高精准的定量优势，已经得到了大规模的使用^[8,9]。而传统的SILAC标记技术主要是将实验组和对照组细胞蛋白中精氨酸与赖氨酸分别替换为重链和轻链同位素标记的精氨酸与赖氨酸，通过质谱分析对比轻链和重链的丰度即定量实验组和对照组中整体的蛋白变化情况。

现有技术在寻找小分子药物靶标的研究中由于检测范围小、检测精度低而造成多种潜在的靶标蛋白未能全局性呈现，给后期的实验验证带来极大困难，非常有必要寻求一种高通量、高精确度的药物靶标鉴定方法。但是到目前为止，在鉴定特定小分子药物的靶标蛋白领域，尚未有研究团队采用蛋白热稳定变化测量技术结合正向-反向同位素标记的定量蛋白质组学的相关报道。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法。

本发明的另一目的在于提供所述蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法，包括如下步骤：