[发明专利]人Lrp4抗原、人Lrp4抗体检测试剂盒及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种人Lrp4抗原的制备方法，其特征在于，所述人Lrp4抗原包括以下任意一种片段或者六种片段：

片段1：Lrp4-26，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

片段3：Lrp4-431，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

片段4：Lrp4-598，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

片段5：Lrp4-805，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

片段6：Lrp4-1041，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

片段7：Lrp4-1381，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述人Lrp4抗原的制备过程包括如下步骤：

步骤1、将Lrp4-26、Lrp4-431、Lrp4-598、Lrp4-805、Lrp4-1041、Lrp4-1381的6个片段的DNA序列分别进行基因合成，设计引物PCR扩增后，分别连接进表达载体，构建6个重组表达质粒；

步骤2、将构建好的重组质粒分别转化进入表达菌，构建6个重组表达工程菌；

步骤3、Lrp4-26、Lrp4-431、Lrp4-598、Lrp4-805、Lrp4-1041、Lrp4-1381的抗原片段的诱导表达及纯化。

2.如权利要求1所述人Lrp4抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤1中PCR扩增的反应体系为：H₂O 38.7ul；Buffer 5ul；dNTP 3ul；上引物1ul；下引物1ul；DNA 1ul；Taq E0.3ul；扩增程序为：94度变性5min；94度变性45sec、57度150sec、72度90sec，32个循环；72度延伸10min。

3.如权利要求1所述人Lrp4抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤3中诱导表达的具体步骤为：将6个重组菌分别接种于LB培养液中摇菌至OD600至0.6-0.8时，按1:1000加入24mg/ml浓度的IPTG诱导4-6小时；

所述步骤3中诱导表达后的纯化条件是：上样缓冲液：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、10mM咪唑；或者上样缓冲液：8M尿素、0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、10mM咪唑；结合缓冲液：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、20mM咪唑；洗脱缓冲液：0.5M Nacl、20mM Na₂HPO₃、500mM咪唑。

4.一种人Lrp4抗体检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：

(A)包被有权利要求1所述的人Lrp4抗原的ELISA酶标板；所述人Lrp4抗原包括Lrp4-26、Lrp4-431、Lrp4-598、Lrp4-805、Lrp4-1041、Lrp4-1381中的任意一种或者6种；

(B)标准阴性血清：Lrp4抗体阴性的血清；

(C)标准阳性血清：Lrp4抗体阳性的血清；

(D)辣根过氧化物酶标记的酶标二抗：抗人IGG、IGM和IGA；

(E)样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液。

5.如权利要求4所述的人Lrp4抗体检测试剂盒，其特征在于，所述人Lrp4抗原中Lrp4-26、Lrp4-431、Lrp4-598、Lrp4-805、Lrp4-1041和Lrp4-1381的包被浓度分别为300ng/ml、250ng/ml、200ng/ml、150ng/ml、200ng/ml和250ng/ml。

6.一种人Lrp4抗体的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括以下步骤：

S1、制备检测ELISA酶标板：包被缓冲液将权利要求1所述的人Lrp4抗原稀释后加到酶标板中吸附，空干包被用洗液，加包被用封闭液封闭；

S2、待检血清、阴性血清、阳性血清分别作为一抗，加样至ELISA酶标板孔中进行孵育；

S3、酶标二抗的孵育：辣根过氧化物酶标记的酶标二抗加入ELISA酶标板，洗涤液洗涤，甩干；

S4、加入显色液，室温避光孵育，加入终止液终止反应；在酶标仪上450nm波长下测定OD值；

所述检测方法为非疾病的诊断和治疗目的。