[发明专利]检测慢性淋巴细胞白血病基因突变的组合物

说明书

本发明属于生物医药技术领域，本发明要求保护一种检测慢性淋巴细胞白血病基因突变的组合物，包括建立含MYD88 p.L265P基因突变的突变子的引物和HRM反应引物。本发明检测组合物采用HRM方法检测能够达到1％的敏感性，并将TAT缩短至0.5天。

技术领域

本发明生物医药技术领域，具体涉及检测慢性淋巴细胞白血病基因突变的组合物。

背景技术

慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)是一类在生物学行为和临床进程上存在很大异质性的恶性B淋巴细胞性白血病。多种分子指标，如免疫球蛋白重链可变区域突变状态、细胞遗传学异常、ZAP-70和CD38 的表达与其预后直接相关。MYD88在固有免疫中起到关键作用并影响B细胞的新陈代谢。MYD88基因的突变，以位于TIR域的L265P突变最为常见。含有这种MYD88突变的慢性淋巴细胞白血病患者有比较明显的NF-KB信号通路基因的表达，他们的临床表现也出现得更早。另外，MYD88基因的突变往往与药物的抵抗和慢淋患者的预后有一定的相关性。因此，检测CLL患者MYD88p.L265P 基因突变对指导临床判断预后和指导用药尤为重要。

随着技术的发展，基因突变检测的方法也日新月异，但是都存在一定的缺陷和不足。

对检测片段进行直接扩增、直接测序是一直以来都是基因突变检测的金标准，它能准确判断每个核酸的类型，能够发现未知突变类型，但是往往耗时耗力、价格昂贵，而且敏感性也比较低。对一些较大的，外显子较多的基因不宜用测序法直接检测突变，同时也不适用于临床对大量的标本进行检测。

HRM是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限，实现了真正的闭管操作。在突变扫描、单核苷酸多态性分析、甲基化研究、基因分型、序列匹配等方面 HRM分析技术发挥着重要作用。

HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。同许多荧光PCR技术一样，HRM是利用了特定的染料可以插入DNA双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链 DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。同时，借助于专业性的分析软件就可以对测试群体实现基于不同形状熔解曲线的基因分型或归类。HRM的优势在于操作简单，分析时间短，灵敏度和特异性高，PCR产物无需后处理(如酶切、电泳等)，可实现真正的闭管操作从而降低污染风险。另外HRM具有高通量的特点，非常适合大量样品的分析。因此HRM检测方法备受关注，并已发展成为SNP基因分型、点突变筛查等的重要手段。

基于这种检测原理，HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规PCR基础上增加一个饱和染料。所以，相比传统的SNP或突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且实现了闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。

现有的对慢性淋巴细胞白血病患者MYD88p.L265P基因突变的检测以PCR 联合直接测序法为主，检测的灵敏度不高，单个样本耗时长，且不利于大通量检测。

发明内容

本发明所要解决问题是在克服现有技术的缺陷，提供一种慢性淋巴细胞白血病MYD88p.L265P基因突变检测组合物，具有高灵敏度、高通量、高特异性的特点，使用该组合物检测时间短，重复性好，且具有广泛适用性。

本发明提供一种检测慢性淋巴细胞白血病基因突变的组合物，所述组合物包括：

(1)建立含MYD88p.L265P基因突变的突变子的引物：