[发明专利]一种诱导脐带间充质干细胞向肾小管上皮细胞分化的方法

说明书

本发明公开了一种诱导脐带间充质干细胞向肾小管上皮细胞分化的方法，包括以下步骤：将脐带间充质干细胞使用诱导培养基培养，所述诱导培养基为LG‑DMEM培养基，并含有终体积分数(8‑12)％FBS、终浓度10^－8‑10^－6MRA、终浓度9‑11ng/mL黄芪甲苷、终浓度90‑110U/mL青霉素、终浓度90‑110U/mL链霉素、终体积分数(8‑12)％输尿管芽细胞条件培养基。本发明实现了体外高效地诱导脐带来源间充质干细胞向肾小管上皮细胞方向分化，为肾脏疾病的细胞治疗提供细胞供体。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种诱导脐带间充质干细胞向肾小管上皮细胞分化的方法。

背景技术

药物性肾损伤表现为急性肾小管损伤，甚至出现肾小管坏死，导致肾功能衰竭。治疗肾衰竭的方法通常采用透析和肾移植，由于肾源的不足和免疫排斥反应，治疗效果不佳。随着干细胞的深入研究，干细胞成为细胞治疗的首选供体来源。目前诱导干细胞定向分化的研究已取得了有意义的进展，如CN109022361A公开了通过分离筛选脐血CD34+CD126-细胞，并与脐带间充质干细胞共培养的方式诱导分化巨核祖细胞；CN108865986A公开了将间充质干细胞与滑膜细胞进行间接共培养，收获共培养后的间充质干细胞冻存，滑膜细胞与脐带间充质干细胞按照4:1的密度比例接种进行共培养后所获得的脐带间充质干细胞在相同的诱导条件下更易向软骨方向分化；CN107630003A公开了将脐带间充质干细胞用包括白皮杉醇和基本培养基的诱导培养基培养，定向分化得到神经样细胞。但脐带来源干细胞在体外向肾脏方向分化的诱导方法和机制的研究，鲜少报道。

文献(损伤性肾匀浆体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞转分化效果及可能机制的研究.重庆医学.2016年03期)利用损伤性肾匀浆体外模拟急性肾损伤的微环境，探讨了骨髓间充质干细胞(BMSC)诱导转分化及其可能机制。方法：将体外培养的BMSC用10％大鼠缺血再灌注损伤肾匀浆上清液进行培养。7d后检测形态学改变、18型角蛋白(CK-18)、肝细胞生长因子(HGF)、骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的相应表达水平。结果：损伤肾匀浆诱导7d后，骨髓间充质干细胞形态发生明显变化，并检测到CK-18阳性表达；同时被诱导的HGF和BMP-7表达水平明显升高。结论：损伤肾匀浆可诱导BMSC部分向肾小管上皮样细胞转分化，其可能机制是BMSC可能以旁分泌的形式产生了HGF和BMP-7等“肾脏保护因子”。文献(体外诱导骨髓间充质干细胞向肾小管上皮细胞的分化.中国组织工程研究与临床康复.2007年03期)公开了在缺血再灌注损伤大鼠肾脏匀浆及全反式维甲酸的联合诱导下，骨髓间充质干细胞可向肾小管上皮样细胞分化。文献(Differentiation of murine embryonic stem cellstoward renal lineages by conditioned medium from ureteric bud cells in vitro.生物化学与生物物理学报：英文版.2010年第7期)公开了ES在无白血病抑制因子(LIF)条件下培养形成拟胚体(EB)，用不同浓度的RA(10^-6M，10^-7M，10^-8M)和Activin(1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml)处理ES 6d，RT-PCR、Brachyury和Pax2免疫荧光染色、流式细胞检测、Westernbloting对分化的细胞进行鉴定。分离培养小鼠13d胚胎肾脏输尿管芽细胞，分离的单细胞被荧光素标记的双花凝集素(FITC-DBA)孵育后，流式分选输尿管芽阳性细胞，收集离体培养输尿管芽细胞的培养上清，经处理作为条件培养液，诱导已分化为中胚层的细胞，使其向着肾系方向分化。结果表明：10^-7M RA和10ng/ml Activin为ES细胞分化中胚层的最佳诱导条件，中胚层分化率在72％。体外分离胚胎肾脏输尿管芽细胞，纯度达到69％。收集离体培养输尿管芽细胞的培养上清，作为条件培养液，诱导中胚层细胞向肾小管上皮细胞分化。免疫细胞化学结果表明在分化的细胞中，检测到了肾脏发育早期相关基因Pax2、WT1和晚期相关基因POD、E-cadherin的表达，DBA染色结果表明分化的细胞具有肾小管细胞的特征。但还未见高效的诱导脐带来源的间充质干细胞向肾小管上皮细胞分化的方法。