[发明专利]胎盘血CIK细胞改良的培养方法

说明书

本发明涉及一种胎盘血CIK细胞改良的培养方法。该方法包括：1)将由胎盘血分离得到的单核细胞接种于包被有CD3抗体及CD28抗体的培养容器中进行培养；培养体系中的细胞因子为IFN‑γ；2)向培养体系中加入IL‑2，IL‑12，IL‑15，CD16抗体；3)换液，新的培养体系中的细胞因子为IL‑2，IL‑12，IL‑15；所述培养体系中的基础培养基为含4％～6％自体血浆的GT‑T581培养基；4)补加IL‑2，培养2～4天后收获细胞。该方法CIK扩增效果好，且活化的CIK占比更高、T‑reg细胞占比更低。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种胎盘血CIK细胞改良的培养方法。

背景技术

胎盘是胎儿与母体之间物质交换的重要器官，是人类妊娠期间由胚胎胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间组织结合器官。胎儿在子宫中发育，依靠胎盘从母体取得营养，而双方保持相当的独立性。

胎盘血的采集量一般在150mL以上，最多可以采集250mL，可采集量高于脐带血。胎盘血中富含原始造血干细胞，其数量和质量与骨髓媲美，数量高于脐带血中造血干细胞含量。

白细胞含量11～19×10⁹，远高于外周血，略高于脐带血。其中的单核细胞含量高于外周血和脐带血含量，单核细胞的含量将近脐血的2倍。

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells，CIK)是一群在体外经IL-1α、IL-2、IFN-γ及抗CD3单克隆抗体等诱导而成的以CD3+CD56+细胞为主的CD4+和CD8+效应T细胞群，兼具有T细胞强大的杀瘤活性以及NK细胞的非主要组织相容性复合体(MHC)限制性杀瘤的优点。

与其他过继免疫治疗细胞相比，CIK具有增殖速度快、杀伤活性高、杀瘤谱广以及副作用小等特点，对正常骨髓造血功能影响甚微，被临床认为是一种有效的肿瘤免疫治疗手段。广泛应用于肾癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌和白血病等多种恶性肿瘤的治疗。

CIK可通过多种途径发挥抗肿瘤作用。CIK对肿瘤细胞有直接杀伤作用，通过分泌颗粒酶和穿孔素穿透靶细胞膜，直接导致肿瘤细胞破裂；CIK具有较强的细胞毒活性，可分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α和GM-CSF等多种细胞因子进一步提高免疫效应细胞的细胞毒作用，不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调节免疫系统间接杀伤瘤细胞，诱导肿瘤细胞凋亡。现有技术中的CIK培育方法，普遍存在扩增倍率低、细胞活性差等问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新颖的胎盘血细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells，CIK)的培养方法，该方法操作简单，培养得到CIK质量较好，可用于CIK的大量制备，使该方法更利于推广和应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及一种胎盘血CIK细胞改良的培养方法，包括：

1)将由胎盘血分离得到的单核细胞接种于包被有CD3抗体及CD28抗体的培养容器中进行培养；培养体系中的细胞因子为IFN-γ900U/mL～1100U/mL；

2)向培养体系中加入IL-2终浓度为900U/mL～1100U/mL，IL-12终浓度为1.5ng/mL～2.5ng/mL，IL-15终浓度为8ng/mL～12ng/mL，CD16抗体终浓度为1.5μg/mL～2.5μg/mL；

3)换液，新的培养体系中的细胞因子为IL-2 900U/mL～1100U/mL，IL-15 4ng/mL～6ng/mL，IL-12 1.5ng/mL～2.5ng/mL；所述培养体系中的基础培养基为含4％～6％自体血浆的GT-T581培养基；