[发明专利]一种可溶性PCV3Cap蛋白及其编码基因和应用

说明书

本发明公开了一种可溶性PCV3Cap蛋白及其编码基因和应用。本发明将PCV3 Cap基因密码子进行昆虫细胞偏嗜性优化、修饰，得到新的重组基因。该重组基因能够表达可溶性的3Capm蛋白，该3Capm蛋白可以包装形成病毒样颗粒，将3Capm蛋白与佐剂制成亚单位疫苗，小鼠和猪体免疫试验均发现其可以有效诱导体液免疫和细胞免疫，表明3Capm蛋白具有较好的抗原性、免疫原性，由此可以看出本发明的3Capm蛋白可以用于疫苗研制，为PCV3的防控提供了思路，为PCV3疫苗的研究奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种编码可溶性PCV3 Cap蛋白的基因，还涉及一种可溶性PCV3 Cap蛋白、还涉及该可溶性PCV3 Cap蛋白的制备方法及其在制备治疗猪圆环病毒3型疫苗中的应用。

背景技术

猪圆环病毒病由猪圆环病毒引起，猪圆环病毒（PCV）分为三个血清型，PCV1、PCV2以及PCV3。普遍认为PCV1对动物没有致病性。目前，病毒感染特性和致病性研究最清楚的是PCV2。PCV2可以引起猪圆环病毒相关疾病（PCVAD），更为严重的是，PCV2的感染会损害宿主的免疫力，引起猪群免疫抑制，更容易导致其他细菌或病毒的继发感染。PCV2的感染另一个重要特点是持续性的感染，亚临床感染比例高，猪群虽然不表现临床症状，但是可以长期带毒，并向外界环境排毒，使PCV2的防控更加困难。目前，已经报道的PCV2基因型有PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e。PCV2a、PCV2b和PCV2d流行趋势在最近几年的改变，使PCV2防控工作更加复杂。自20世纪90年代发现以来，PCV2已经对养猪业造成了巨大危害。

PCV3于2016年首次发现，已经在亚洲、美洲、欧洲等很多国家和地区出现，但是感染特性和致病性研究尚无大的进展，最主要的困难是PCV3体外培养未能实现。已有研究证实PCV3不能在猪睾丸细胞（ST）、猪肾上皮细胞（PK15）、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）、非洲绿猴肾细胞（Vero）中增殖，病毒的体外培养需要尝试更多的细胞和组织。2016年，PCV3首先在患有PDNS的猪群中发现，临床表现为：患病母猪流产率升高、产出死胎、木乃伊胎，胎儿也表现出PDNS的症状，但是对常见病原体的检测结果均为阴性，定量PCR、免疫组化检测结果也表明PCV2为阴性，因此推测临床症状由PCV3引起。此外，还在有呼吸系统疾病综合征、腹泻、猪心肌炎以及多系统性炎症的猪体内检测到PCV3的存在，这些病例中，亦有与PCV2共感染的情况，推测PCV3感染也可能在一定外界环境下引起临床发病。

目前，疫苗接种是控制PCV2感染的主要途径。针对PCV2的商品化疫苗主要有勃林格的亚单位疫苗CircoFLEX、梅里亚的灭活疫苗Circovace、默沙东的亚单位疫苗Circumvent和Porcilis PCV亚单位疫苗，以及辉瑞公司的 Fostera^TM PCV灭活嵌合体疫苗以及国内SH株、LG株等灭活疫苗，青岛易邦的大肠杆菌表达系统亚单位疫苗等。其中，杆状病毒系统表达的PCV2a Cap蛋白亚单位疫苗能够诱导高水平的免疫应答，产生速度快，能够有效降低组织和血清中病毒载量，保护效果也更持久。但是，PCV3 ORF2基因和PCV2的ORF2基因表现出较大的差异，同源性仅37%左右，二者基因结构的巨大差异，表明二者不存在交叉保护作用。因此，PCV2的商品化疫苗无法满足PCV3的防治要求，开展PCV3疫苗研制十分必要。

一些病毒的结构蛋白可以组装成VLPs（病毒样颗粒），其本质是蛋白质复合物，不含遗传物质。由于VLPs含有功能性的病毒蛋白，可以进入细胞，是研究病毒结构蛋白功能的常用方法之一。截止2015年，已报道110余种VLPs，各种蛋白质表达系统均可产生VLPs。其中杆状病毒表达系统表达外源蛋白培养简单、生长速度快、培养效率高，蛋白修饰功能类似于其天然修饰方式，利于VLPs的形成和抗原性的保持。由于不含有遗传物质，VLPs不会在体内复制，提高了其生物安全性。此外，使用其免疫动物还可以区别动物自然感染和免疫作用。目前，世界上有四种VLPs疫苗批准生产，其中兽用疫苗有PCV2亚单位疫苗和兔出血热疫苗。众多VLPs疫苗正在试验中，表明以VLPs为抗原的亚单位疫苗和杆状病毒表达载体具有广阔的发展前景，因此，PCV3疫苗的研制也可以向这一方向努力。