[发明专利]一种腺病毒快速纯化方法

说明书

本发明属于病毒制备技术领域，具体涉及一种腺病毒的小规模（微量）快速纯化方法。本发明通过采用切向流超滤系统来降低病毒液中的污染性核酸酶的浓度，其中，所述的切向流超滤系统为Sartorius公司的Vivaspin超滤离心管。本发明所述方法经过有限次数的超离能够有效去除病毒液中的核酸酶，使得病毒回收率和所得到的病毒DNA纯度更高，具有所需设备简单、纯化周期短的优点。

技术领域

本发明属于病毒制备技术领域，具体涉及一种腺病毒的小规模(2ml-10ml)包括微量病毒原液(200微升)的快速纯化方法。

背景技术

病毒载体在基因治疗方面发挥日益重要的作用，尤其是腺病毒载体，是产生病毒疫苗和基因治疗载体的最合适平台，在基因治疗方面得到了广泛应用。腺病毒颗粒大小适中(90～100nm)，无包膜，二十面体的核衣壳内包裹着一条36kb大小的线性双链DNA，具有感染宿主广泛、载体容量大的优点，是一种理想的新型病毒疗法候选者。重组腺病毒载体在基因治疗方面的应用要求其不仅要纯度高，而且能够保持较高的感染活性，因此腺病毒颗粒的纯化工艺尤为重要。

目前，在病毒纯化方面最为成熟的技术是氯化铯密度梯度离心法，该方法可以获得纯度较高的病毒颗粒，但此法对于设备的要求极其高，需要超高速离心机，成本高，而且纯化所需时间长，操作不方便。另一类应用广泛的纯化方法是层析纯化，例如体积排阻层析，粒子交换层析，亲和层析等，这些方法共同的特点是纯化周期长，步骤繁琐。这两类方法都不适用于实验室小规模快速纯化腺病毒颗粒。因此，需要探索一种更有效的小规模快速纯化腺病毒方法，以期获得理想的病毒回收量，以满足科研需求。

腺病毒颗粒纯化的目的是获得纯净的腺病毒载体，便于后续的科研或临床治疗工作。腺病毒纯化的关键在于去除或破坏宿主细胞DNA，通常借助核酸酶进行去除，适宜的核酸酶有Benzonase，Pulmozyme以及其他任何在本领域内常用的DNA酶或RNA酶。添加核酸酶消化宿主细胞DNA后，会有部分核酸酶残留在病毒液中。就Benzonase核酸酶为例，其属于混合型核酸内切酶，可以消化所有结构的DNA和RNA，所以纯化的腺病毒颗粒中必须不能含有Benzonase核酸酶以防腺病毒基因组被消化。因此，腺病毒纯化的关键一步是将病毒液中残留的核酸酶去除。目前市售的相关腺病毒纯化试剂盒具有一定的去除核酸酶的作用，但是最终的病毒回收量和纯度不理想，会影响后续的分子克隆操作，难以满足腺病毒载体构建需求。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种腺病毒快速纯化方法。本发明的技术方案是采用切向流超滤系统降低病毒液中的污染性核酸酶浓度。

所述的污染性核酸酶是指病毒液中残留的核酸酶，具体是指为了消化宿主细胞DNA而添加在宿主细胞裂解液中的核酸酶，例如Benzonase，Pulmozyme以及其他任何在本领域内常用的DNA酶或RNA酶。该核酸酶用于去除宿主细胞DNA，但病毒液中残留的核酸酶可能会引起病毒基因组核酸被破坏，造成病毒粒子失去感染活性或感染效率降低，所以对于纯化病毒获得病毒基因组，消化后去除残余的核酸酶是至关重要的。

在一个优选的实施方式中，所述的切向流超滤系统为Sartorius公司的Vivaspin超滤离心管。

Sartorius公司的Vivaspin超滤离心管为带有内层柱管的离心管，内层柱管上具有垂直方向的超滤膜，根据要求该柱管具有不同体体积，超滤膜也具有不同的分子量规格。将适量病毒液放入离心管的上层柱管内，放入离心机进行离心分离，可以使病毒粒子和核酸酶及其他杂质分离，病毒粒子留在上层柱管内，核酸酶及其他杂质进入下层柱管。该切向流超滤系统所需设备相对简单，不需要大型超速离心机，且滤膜方向垂直于离心力方向，分离效率更高。

作为优选，所述方法还包括采用Vivaspin超滤离心管浓缩病毒液的步骤。