[发明专利]三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因及其编码蛋白和应用

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体来说是一种三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因及其编码蛋白和应用。本发明利用转录组测序获得的unigene和RACE技术从三疣梭子蟹中扩增得到PtMBL基因cDNA，发现重组PtMBL蛋白具有显著的抑菌、菌结合和菌凝集活力。重组蛋白PtMBL对革兰氏阴性菌(溶藻弧菌、铜绿假单胞菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌)具有明显的抑制效果，最小抑菌浓度分别为0.81～1.61μM、0.81μM、0.81～1.61μM、3.22～6.44μM。重组蛋白PtMBL对溶藻弧菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和毕赤酵母菌均具有明显的结合活力。此外，在Ca²⁺存在下，重组蛋白PtMBL对溶藻弧菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和毕赤酵母菌具有明显的凝集效果。本发明为三疣梭子蟹的病害防治奠定了基础，在开发抗菌药物、菌凝集制剂、新型免疫制剂、饲料添加剂生产等方面具有潜在的应用价值。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体的说是一种三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

补体系统是先天免疫系统的重要组成部分，也是联系先天免疫和获得性免疫的纽带。脊椎动物补体系统的激活主要通过三条途径，即经典途径(classic pathway)、凝集素途径(lectin pathway)和替代途径(alternative pathway)。无脊椎动物缺乏真正的抗体和特异性的免疫细胞，机体防御反应主要依靠先天免疫系统，其中补体凝集素途径既不需要经典途径中抗原—抗体复合物的存在，也不像替代途径中缺乏特定的识别分子，而是依赖模式识别受体与微生物多糖结合而启动，在无脊椎动物免疫防御中具有十分重要的生物学意义。

甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin,MBL)属于Collectin家族，能够识别病原微生物表面的甘露糖残基并激活脊椎动物补体凝集素途径。脊椎动物中的MBL主要包含N-末端半胱氨酸富集结构域、胶原样结构域、颈区和C-末端糖识别结构域(CRD)。其中，胶原样结构域能够与MBL相关丝氨酸蛋白酶MASP结合形成复合体，而CRD在钙离子参与下能够参与对微生物的识别，特别是CRD中的EPN(Glu-Pro-Asn)基序仅特异性的识别甘露糖，从而引发补体激活、吞噬作用或炎症反应来清除细菌。无脊椎动物补体凝集素途径研究起步较晚，在尾索动物海鞘中仅发现了MBL的类似分子，即葡萄糖结合凝集素GBL。

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一种重要的海产经济蟹类，由于其营养价值丰富、生长迅速等优点，已成为我国重要海水养殖品种。随着养殖规模不断扩大以及集约化程度不断提高，由细菌、真菌等引起的各种疾病日趋严重，给梭子蟹养殖业造成巨大的经济损失。病害的不断爆发和病因的多样性迫切需要从三疣梭子蟹自身的免疫防御因子入手研究其抗病机制和开发新型的抗菌药物。到目前为止，关于三疣梭子蟹PtMBL的研究尚少。因此，开展PtMBL的研究对理解三疣梭子蟹的免疫防御机制、进行病害防治具有重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明旨在提供一种三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因及其编码蛋白和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因，三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL基因为序列表由SEQ ID No.1中的碱基序列所示。

所述三疣梭子蟹甘露糖结合凝集素PtMBL的cDNA序列克隆包括下列步骤：

a)三疣梭子蟹总RNA的提取及检测；

b)三疣梭子蟹文库构建；

c)三疣梭子蟹转录组测序及分析；

d)三疣梭子蟹unigene序列的同源性分析及PtMBL基因片段的筛选；