[发明专利]利用重组酿酒酵母与桦褐孔菌混菌体系制备白桦脂酸方法

说明书

本发明公开了一种利用重组酿酒酵母和桦褐孔菌混菌体系制备白桦脂酸方法，包括：将重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303‑1加入到桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC 83414培养体系中，于20‑30℃混合发酵培养2‑5天，培养完成后，收集桦褐孔菌CFCC 83414的菌体和发酵液，通过后处理从菌体和发酵液中分离纯化得到白桦脂酸。本发明方法利用重组酿酒酵母‑桦褐孔菌混菌体系直接转化葡萄糖合成白桦脂酸，制备方法简单，周期短，后期处理方便，能有效提高桦褐孔菌转化生成白桦脂酸的得率，为桦褐孔菌中白桦脂酸合成调控及工业化生产提供了一种新的思路。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用重组酿酒酵母与桦褐孔菌混菌体系制备白桦脂酸方法。

背景技术

白桦脂酸(Betulinic acid，简称BA)是一类五环羽扇烷型的三萜化合物。近年来的研究表明，BA具有多种多样的生物活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗菌、抗疟疾等，尤其是在抗肿瘤和抗HIV方面，特别是针对黑色素肿瘤细胞具有专一的杀死作用，因此得到了广泛关注。更重要的是BA衍生物抗HIV II期临床实验已经取得成功，所以BA目前已被认为是最具潜力的药物先导化合物之一。最近，大量的体内外实验证明白桦脂酸还具有其他临床功能。白桦脂酸可以减缓乙醇诱导的肝星状细胞的激活，通过抑制肝葡萄糖的产生来缓解高血糖症，增强免疫应答，通过抑制胰脂肪酶达到减肥的效果，还可以保护心肌免受由于缺血再灌注引起的损伤以及有助于治疗化学性的甲状腺功能低下症。

目前BA的制备方法，主要有以下三种：1天然提取法，2化学合成法，3微生物转化法。目前，白桦脂酸植物提取的主要来源是白桦树皮，但其中BA含量很低，仅为0.025％～2％。天然提取法虽然方法简单，但是BA在植物中的含量很少，因此对原料的消耗极大，杂质较多，产率低下，还没有潜在的工业化价值。白桦脂酸早在1938年已被化学合成，均是以白桦脂醇为原料，经过一系列氧化还原反应最终生成白桦脂酸。目前，化学合成法制备白桦脂酸较多地应用于生产实践中，虽然合成效果较好，但存在操作复杂、污染大、合成成本高、安全性低等问题，限制了其在实际中的应用，有待进一步改善提高。微生物转化法是利用生物在代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物催化反应得到目标产物。与化学合成方法相比，微生物转化具有高立体选择性、反应条件温和、污染小、费用低，这种方法具有工业化的潜力。目前有几种真菌已被证实可以完成白桦脂醇到白桦脂酸转化，分别为Armillarialuteo-virens Sacc ZJUQH100-6、Cunninghamella blakesleeana、Aspergillus foetidusZU-G1和Aspergillus oryzae AS 3.498，但产率仍然不能满足商业化需求。

代谢工程和合成生物学的快速发展为在微生物宿主内获得高产的天然产物提供了很好的解决方法，但现在很少有将这些技术应用到白桦脂醇的转化方面的研究。白桦脂醇转化生成白桦脂酸是C28位的羟基氧化为羧基，可通过基因工程的手段将具有C28位氧化功能的基因与相应的还原酶基因导入酿酒酵母完成转化。目前，已发现的具有C-28位氧化功能的基因有来自Medicago truncatula的CYP716A12，Vitis vinifera的CYP716A15，Panaxginseng的CYP716A52v2和Catharanthus roseus的CYP716AL1。

发明内容

本发明提供了一种利用重组酿酒酵母与桦褐孔菌混菌体系制备白桦脂酸方法，提高了桦褐孔菌生物转化合成白桦脂酸的得率。

一种利用重组酿酒酵母和桦褐孔菌混菌体系制备白桦脂酸的方法，包括：将重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303-1加入到桦褐孔菌(Inonotus obliquus)CFCC83414培养体系中，于20-30℃混合发酵培养2-5天，培养完成后，收集桦褐孔菌CFCC 83414的菌体和发酵液，通过后处理从菌体和发酵液中分离纯化得到白桦脂酸。