[发明专利]MdrP突变体的基因、氨基酸、蛋白功能及药物积累活性检测

说明书

本发明属于蛋白质技术领域，公开了一种MdrP突变体的基因、氨基酸、蛋白功能及药物积累活性检测，在含有阳离子(Na⁺、K⁺)的Buffer中加入CCCP移除跨膜H⁺梯度只保留跨膜阳离子梯度驱动蛋白转运，或在buffer中分别加入Monensin或Nigericin移除阳离子梯度只保留跨膜H+梯度来驱动蛋白转运，实现不同驱动作用之间的相对定量对比。本发明明确了MdrP蛋白高度保守氨基酸位点的重要功能，证明了MdrP蛋白是一个H⁺和Na⁺驱动的药物外排蛋白；N146是H⁺结合位点，D223、Q242是Na⁺、H⁺竞争结合位点，或可以成为对MFS家族抗药蛋白理解的有利理论支撑。

技术领域

本发明属于蛋白质技术领域，尤其涉及一种MdrP突变体的基因、氨基酸、蛋白功能及药物积累活性检测。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

现有双功能蛋白的解析，尚未有关键的功能决定性氨基酸位点明晰，即某决定一种功能活性的重要位点。更多的是在蛋白水平上进行阐释，即在结晶蛋白中直观确认相关蛋白，或在氨基酸定点突变体的纯化蛋白水平上进行ITC生化实验确定底物结合作用，从而研究特定位点对底物(离子或分子)的结合作用。

现有技术方案多为诺氟沙星药物积累实验，在含有Na⁺、K⁺(或不含)的Buffe中加入CCCP移除跨膜H⁺梯度，积累值剧烈上升以证实该蛋白具有药物外排活性，且跨膜H⁺梯度可以作为驱动力。就与本技术最相似的技术方案为诺氟沙星积累实验，具体步骤如下，以MdrP蛋白为例进行阐述：

1)CM2/pEASY-T3与CM2/pEASY-MdrP在含有40mM Tris-乳酸的LB培养基中37℃过夜培养，OD600值达1.0时离心收菌。

2)收获的细胞，用0.1M Tris-HCl(pH 7.0)溶液将菌体重悬洗涤三次，洗涤后用相同溶液重悬并加入终浓度为100mM的NaCl或KCl(或不加)，使最终细胞密度OD600值为1.0。

3)将上述菌悬液样品室温孵育5min后，加入终浓度为100μM的诺氟沙星，按照5min/次的时间间隔取样3次，逐次取样1mL，8000rpm，1min，4℃离心，0.1M Tris-HCl(pH7.0)溶液洗涤一次，并用0.1M甘氨酸-盐酸(pH 3.0)溶液重悬。

4)取样3次后立即向诺氟沙星体系中继续加入CCCP至终浓度为100μM，再按照加入后5min/次的时间间隔取样3次，逐次取样1mL，8000rpm，1min，4℃离心，并用0.1M甘氨酸-盐酸(pH3.0)溶液重悬。

5)以上取样室温下(25℃)剧烈震荡1h后，8000rpm离心1min，留上清，0.1M甘氨酸-盐酸(pH 3.0)溶液将上清液进行1:1稀释后，直接用于荧光定量检测。

6)荧光监控参数设置：激发光(EX)波长227nm，发射光(EM)波长488nm。

但是，现有技术方案测定诺氟沙星药物积累实验，仅仅可以证实该蛋白却有活性且跨膜H⁺梯度可以作为驱动力，却没有单独明确研究其他阳离子(Na⁺、K⁺)的影响作用，更没有与H⁺驱动效果进行相对定量的对比分析，对于不同的离子结合更常用的方法是更多的是在蛋白水平上进行阐释，却又不能以单一实验确定结合且在转运中有效起到作用，实验费时费力。

综上所述，现有技术存在的问题是：