[发明专利]一种几丁质酶耐低温突变体及其应用

说明书

本申请通过在现有技术公开的筛选自海洋微生物的耐低温几丁质酶，经过PCR引入突变后中筛选，获得一个与野生型对比具有5个氨基酸位点突变的突变体，经过最适应的温度检测，该突变体最适应温度较野生型降低了5℃，更利于所述的酶应用于几丁质的水解。

技术领域

本发明属于基因筛选改造技术领域，具体涉及一种几丁质酶酶(glucosidase)及其应用，具体涉及一种通过基因突变的方法筛选获得几丁质酶的突变体以及几丁质酶耐低温突变体的在几丁质降解中的应用。

背景技术

几丁质又称甲壳素、甲壳质,它广泛存在于甲壳纲动物、软体动物和节肢动物外壳中,如虾、螃蟹、蝗虫等,此外在藻类、贝类、真菌类的细胞壁及高等植物中也广泛存在,是目前自然界中仅次于纤维素的第二大生物资源,但比纤维素具有更多的特殊功能。几丁质是一种白色或灰白色、半透明片状晶体,无味,为天然粘多糖。化学名称为1,4-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D葡聚糖,基本单位是乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)为一种直链状聚合物化学结构如下,根据分子链的排列方式,它存在α,β,γ三种晶型物。由于该多聚糖大分子间有较强的氢键作用,所以其理化性质非常稳定。含量最大的α-几丁质，由两条反向平行链组成，多氢键相连，浸水不胀；β-几丁质，由两条同向平行链构成，分子链间的氢键较小几丁质少的多，遇水会膨胀；γ-几丁质，为三条链，两条同向，一条反向，类似于α-和β-几丁质的混和晶体。

来自海洋生物圈的几丁质占几丁质总量的绝大部分，然而几丁质在海底沉积却很少，这主要与海洋微生物对几丁质的有效分解有关。海洋微生物通过分泌几丁质酶分解几丁质作为自身生长繁殖的碳源和氮源，推动了几丁质的再循环。几丁质是海洋环境中一种丰富而且重要的营养和能量物质，海洋微生物通过几丁质酶对几丁质进行降解和利用是海洋环境中营养物质循环的关键，对维持海洋环境生态系统的平衡也很重要。

最近几丁质引起了研究者的极大兴趣，将它们转化成低聚糖，低聚糖不但溶解于水，而且拥有多种生物功能，如抗肿瘤活性和抗真菌活性。目前，几丁质低聚糖在工业上是通过化学法制备的，这存在很多问题，如有很多短链低聚糖产生，低聚糖产量低，分离成本高，而且易对环境产生污染。相对的，酶解几丁质有许多优点，环境兼容性，成本低，可重复。近年来，几丁质的酶法水解变得越来越受欢迎。

与陆地几丁质酶相比，海洋几丁质酶有更高的pH和盐度忍受力，有助于特别的应用。Stefanidi等从生活在南太平洋1 200m处的样品中分离到的嗜冷细菌能够分泌几种几丁质酶降解几丁质。几丁质酶还发现于Alteromonas sp.strain O-7、Vibrioanguillarum、V.parahaemolyticus。

低温酶主要有以下四个生理生化特点：(1)在低温下的具有高周转率(Kcat)和高催化效率(Kcat/Km)是低温酶的主要适应特性。它们可以弥补低温导致化学反应速率降低带来的影响，为生物提够足够的代谢活力并维持足够的代谢通量。高催化效率(包括Km值的下降)对低温酶尤为重要，因为她可以保证低温下底物与酶活性位点的充分结合。(2)最适作用温度低或在低温下有高催化活性是酶归类为低温酶的先决条件。低温酶的最适反应温度一般低于40℃，与普通的中温酶相比，低了10℃到20℃。目前已报道的低温几丁质酶的最适作用温度最低在30℃。(3)结构柔顺性是低温酶的另一个特点。低温酶柔顺、松散和开放的结构特征，有助于提高酶分子在催化过程中的构象变化能力。当温度下降，随着蛋白结构柔顺性的降低以及冷变性作用，酶的催化速率随之下降。而低温酶的高柔顺性，一方面为底物到达酶的活性位点提供更佳的通道和容纳位置，提高酶活性位点与底物之间的结合互补性，并有利于底物的释放：另一方面可降低活化能以补偿反应分子的低动能，减少容纳庞大底物所耗费的能量，在低能耗情况下保证酶的高催化效率(4)低温酶的热稳定性差。低温酶结构的高度柔顺性可能造成蛋白的离子配位松散，并且由于缺乏二硫键及刚性的二极结构，导致低温酶对热变性和化学变性敏感，稳定性降低。此外，低温酶所处的自然环境缺乏热选择性压力，可能也是造成蛋白结构热不稳定性的原因。