[发明专利]苯丙氨酸代谢变化在脑缺血/再灌注损伤程度评价中的应用

说明书

本发明公开了苯丙氨酸代谢变化在脑缺血/再灌注损伤程度评价中的应用：采用液质联用技术对生物体或细胞中苯丙氨酸的含量进行检测，根据在给予药物或其他干预措施前后苯丙氨酸的含量变化，从而对干预措施下脑缺血/再灌注损伤程度变化进行评价。本发明通过样本中苯丙氨酸含量的变化情况对脑缺血/再灌注损伤程度的变化进行直观判断，方便快捷，对现有脑缺血/再灌注损伤程度的评价可以起到有效的补充和支持，为药物或其他干预措施的效果评价、新药开发中的药效评价提供新的参考。

技术领域

本发明属于神经医学领域，涉及利用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS方法)检测外周血等样本中苯丙氨酸含量变化，用于在药物试验中评价脑缺血/再灌注损伤程度的变化。

背景技术

脑卒中在医学上是指由于血流不畅导致的脑部细胞死亡。脑卒中主要分为缺血性(由于血供不足造成)和出血性(由于出血造成)两类。颈内动脉和椎动脉的闭塞、狭窄等，均易引发缺血性脑卒中，导致脑功能的部分丧失，且男性多发。据统计，全球有大约4240万脑卒中病史的患者存活。在1990至2010年间，发达国家脑卒中患者的数量以每年大约10％的速度下降，而在发展中国家则是以每年约10％的速度递增。2016年脑卒中死亡患者达630万，占总体死亡人数的11％。大约一半的脑卒中患者生存期小于1年。我国每年约有150～200万新发脑卒中病例，其中约70％是缺血性脑卒中，已经成为我国仅次于恶性肿瘤和心血管疾病的第三大致死原因和首要致残病因。缺血性脑卒中的主要原因是血管阻塞或狭窄，导致局部的脑组织血供不足；而出血性脑卒中则是由于脑动脉瘤破裂等原因，导致血液直接进入脑组织或是脑膜间隙所致。国家卫计委2017年公布的《中国缺血性脑卒中急性期诊疗指导规范》指出，急性缺血性脑卒中的处理应强调早期诊断、早期治疗、早期康复和早期预防再发。溶栓治疗是目前最重要的恢复血流措施，重组组织型纤溶酶原激活剂(rtPA)和尿激酶是我国目前使用的主要溶栓药。然而，大量研究表明，快速的脑缺血后血流再灌注，易诱发缺血灶局部大量炎症细胞的激活和炎症因子的释放，促使神经细胞内反应活性氧(ROS)水平增加和细胞凋亡，最终导致神经细胞发生缺血/再灌注(I/R)损伤。I/R损伤的机制异常复杂，涉及线粒体和ROS损伤、谷氨酸等兴奋性氨基酸的毒性反应、细胞内Ca²⁺的超载、炎症反应、细胞凋亡和自噬等多种机制。

代谢组学(Metabonomics)是对某一个体、组织或细胞内含有的所有代谢产物进行定性和定量分析的一门新兴学科。目前，代谢组学已经与基因组学、转录组学、蛋白质组学等多种组学技术共同构成系统生物学的组学研究技术平台。近年来，随着质谱、核磁共振等检测技术平台的成熟，代谢组学逐渐渗透到各个领域，在脑缺血损伤过程中的应用也是日益深入。近年来，多家实验室相继报道在脑缺血损伤过程中伴随着细胞代谢状态的急剧改变，并且发现了显著变化的代谢标记物。这些内源性代谢物主要与能量代谢、氨基酸代谢和脂类代谢相关：(1)氨基酸类：包括兴奋性氨基酸(EAAs)、支链氨基酸、牛磺酸、甘氨酸、谷氨酰胺、同型半胱氨酸、γ－氨基丁酸等；(2)能量代谢物：包括葡萄糖、乳酸、丙酮酸、酮体、α－酮戊二酸等；(3)其他：花生四烯酸及其代谢产物、5-HT、NO、儿茶酚胺、甘油、肌醇等。其中，能量代谢物和兴奋性氨基酸是目前应用较多的内源性代谢物检测指标。

在评价病情严重程度时，除了使用评分量表，《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》推荐，脑病变检查使用包括平扫CT(首选)、多模式CT、常规MRI、多模式MRI等。血管病变检查常用颈动脉超声、经颅多普勒(TCD)、磁共振脑血管造影(MRA)、高分辨磁共振成像(HRMRI)、CT血管造影(CTA)和数字减影血管造影(DSA)等。然而，这些检查也存在着：需要注射碘造影剂、费用较高、检查时间稍长、患者本身的禁忌症等局限、操作技术水平的影响。AHA/ASA不推荐在静脉溶栓治疗前常规进行MRI检查来排查颅内微出血，不推荐对发病6h内的缺血性脑卒中患者运用灌注检查来选择适于机械取栓的患者。除了以上评价措施，目前药物试验中对于脑损伤的评价一般采用的辅助措施往往需要从组织中取样。但显然，其不仅步骤复杂、耗时，而且对于人用药物临床试验而言是无法广泛采用的。