[发明专利]可用于高灵敏FRET成像的荧光蛋白对及其应用有效
申请号: | 201910057635.8 | 申请日: | 2015-12-31 |
公开(公告)号: | CN109762050B | 公开(公告)日: | 2020-08-28 |
发明(设计)人: | 储军;迈克尔·林;郭育奇;张楚秋;王慧娜 | 申请(专利权)人: | 深圳先进技术研究院 |
主分类号: | C07K14/00 | 分类号: | C07K14/00;C07K19/00;G01N33/68 |
代理公司: | 北京市诚辉律师事务所 11430 | 代理人: | 范盈 |
地址: | 518055 广东省深圳*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 用于 灵敏 fret 成像 荧光 蛋白 及其 应用 | ||
本发明提供了可用于高灵敏FRET成像的荧光蛋白对及其应用。具体而言,本发明提供了一种红色荧光蛋白,该红色荧光蛋白的氨基酸序列与mRuby2的氨基酸序列相比,具有以下突变位点:N33R,M36E,T38V,K74A,G75D,M105T,C114E,H118N,Q120K,H159D,M160I,S171H,S173N,I192V,L202I,M209T,F210Y,H216V,F221Y,A222S,G223N。本发明还提供了一种绿色荧光蛋白,该绿色荧光蛋白的氨基酸序列与Clover的氨基酸序列相比,具有以下突变位点:N149Y,G160S或G160C,A206K。本发明的红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白具有良好的光稳定性,可用于高灵敏FRET成像。
本发明是申请日为2015年12月31日、申请号为201511025610.8、发明名称为“可用于高灵敏FRET成像的荧光蛋白对及其应用”的分案申请,通过引用将其全部内容结合到本发明。
技术领域
本发明是关于可用于高灵敏FRET成像的荧光蛋白对及其应用。
背景技术
荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠,并且两个分子的距离在10nm范围以内时,就会发生一种非放射性的能量转移,即FRET现象,使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多(荧光猝灭),而受体发射的荧光却大大增强(敏化荧光)。而在生物体内,如果两个蛋白质分子的距离在10nm之内,一般认为这两个蛋白质分子存在直接相互作用。荧光共振能量转移技术能够实时监控活细胞内生物分子的活性和分子之间的相互反应,为研究复杂细胞信号通路提供了高时间和空间分辨率的有效方法。随着绿色荧光蛋白应用技术的发展,FRET已经成为检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具,在生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等方面有着广泛的应用。
在生物光学与分子影像技术领域,科学家们一直在努力寻找高效的可用于光学成像的基因编码生物传感器。这些基因编码的生物传感器利用荧光共振能量转移技术实时的监控生物分子的活性和分子之间的相互反应。现在普遍使用的基因编码生物传感器是将青色和黄色荧光蛋白相融合,以青和黄两种颜色的荧光团相搭配,通过荧光共振能量转移实时监控生物分子的活性和分子之间的相互作用。但是这种生物传感器有诸多缺陷,主要表现在以下方面:(1)普通生物传感器中使用的青色和黄色两种荧光蛋白的动态感光范围较低,所以导致成像灵敏度低,很难对细胞内的一些瞬时和微弱生化反应进行监测。(2)光毒性大,在检测活的细胞或样品时,对细胞正常的代谢反应和分子相互作用产生较大的负面影响,导致实验结果出现较大的误差,细胞在长时间成像过程中可能死亡。(3)生物传感器自发荧光干扰。在细胞中成像时,由于传感器本身不可避免的激发青色荧光蛋白的同时可激发细胞内一些内源性分子,比如flavin,会出现自发荧光,所以对实验结果也会造成不同程度的干扰和影响。(4)在激发黄色荧光蛋白时青色荧光蛋白出现光活化。(5)传感器所使用的荧光蛋白对pH敏感,pH发生少许变化时,荧光蛋白可能会失活,荧光会明显减弱。
2012年Lam,A.J.等人开发出来一个GFP-RFP对,两种荧光蛋白分别为Clover和mRuby2。该荧光蛋白FRET对与普通的CFP-YFP FRET对相比提高了反应的敏感性,降低了成像时光毒性,与其它的GFP-RFP对相比性质优越,且该方案也已经成功用于活细胞中Zn2+聚集和CaMKIIα活性的成像。但是不足之处为Clover的光稳定弱,在光连续照射下容易光漂白。而mRuby2的光强度也并不高,所以限制了该荧光蛋白FRET对的使用(Lam,A.J.etal.Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescentproteins.Nat Methods9,1005-1012(2012))。在此将该文献的全部内容并入于本发明中作为参考文献。
发明内容
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