[发明专利]一种水稻复杂性状基因定位的方法

说明书

本发明涉及植物基因定位技术领域，特别涉及一种水稻复杂性状基因定位的方法，本申请采用目标性状差异显著的两个水稻亲本，构建F₂群体，根据表型将F₂群体分成≥3个亚群，并在每个亚群中选取表型一致的≥30个单株，提取DNA构建多个混池进行重测序，通过将每个混池的测序reads与参考基因组序列比对，利用软件GATK检测SNP，采用SNP‑index方法计算对应位点的SNP‑index和ΔSNP‑index值，绘制出ΔSNP‑index的分布图，将显著关联ΔSNP‑index对应区域为候选区域，取相同物理位置上不同ΔSNP‑index的交集对应的区域为最终候选区域，再根据基因注释网站、测序深度和ΔSNP‑index值预测出候选基因。该方法成本低、耗时短、效率高，能定位出多个候选基因，能快速缩小目标基因所在的候选区域，能准确预测出紧密连锁的目标基因数目。

【技术领域】

本发明涉及植物基因定位技术领域，具体涉及一种水稻复杂性状基因定位的方法。

【背景技术】

复杂性状泛指由多基因和非遗传因素共同作用的一类性状。复杂性状涵盖范围广，包括经典的数量性状、表型间断分布的性状以及其他其它复杂性状。研究由多基因控制的复杂性状对于作物适应环境和遗传改良有着重要意义。然而由于复杂性状的基因控制方式较为复杂，单个基因具有相对小的表型效应，且容易受到环境的影响。因此，解析复杂性状的控制基因一直是比较困难的。

利用传统QTL作图可以定位复杂性状基因，但该方法需要构建高世代、大样本群体，采用基于PCR的标记进行基因分型，耗时又耗力，且只能鉴定两个相应的等位基因。近年来，伴随测序技术的快速发展，高通量测序技术已逐渐应用于复杂性状的基因定位，其中，QTL-seq就是一种快速、高效、价廉的基因定位方法。QTL-seq是由日本科学家HirokiTakagi等于2013年首次提出的一种基因定位技术，该方法将集团分离分析法(Bulked-segregant analysis，BSA)与全基因组重测序技术进行结合，鉴定与目标性状关联的QTLs，其具体思路是：子代群体中选择表现出极端性状单株，按照表型分成两组，每组20-50个单株，对每个单株提取DNA，并对DNA分别进行等量混合，形成2个极端表型池，随后进行混池DNA测序，将两个混池的测序reads比对到参考基因组序列，计算对应位点的SNP-index，然后将两个混池的SNP-index值相减进而计算出ΔSNP-index，最后将与性状相关的QTL定位在ΔSNP-index差异比较大的区域。但该方法只构建两个表型极端池，只关联出与目标性状相关的1-2个主效基因。

因此，本申请发明了一种基因定位新方法—PCAMP(Pair-wise ComparisonAnalysis for Multiple Pool-seq)，通过选取目标性状差异显著的两个亲本杂交再自交，获得F₂群体，依据表型将F₂群体分成≥3个亚群，在每个亚群中选取表型一致的≥30个单株，提取DNA组成混池(Bulk)进行基因组重测序，最后通过SNP-index方法进行关联分析，鉴定出目标基因候选区域，进而预测候选基因的方法。

【发明内容】

鉴于上述内容，本发明提供一种水稻复杂性状基因定位的方法，该方法耗时短、成本低、效率高，该方法能定位出多个候选基因，能快速缩小目标基因候选区域，能准确预测出紧密连锁的目标基因数目，为后续研究提供较大的应用价值。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案，包括以下步骤：

(1)群体构建：选取目标性状差异显著的两个水稻亲本，用于构建分离群体；

(2)表型鉴定与分群：对步骤(1)的两个亲本和分离群体中各个单株进行表型鉴定，并根据表型性状对分离群体进行分群；

(3)构建多个混池：在步骤(2)分群的每个亚群中挑选出≥30个单株，每个亚群的单株取新鲜叶片，并采用CTAB法提取每个单株DNA，将各单株DNA等量混合，组成多个DNA混池；