[发明专利]一种快速获得大量高纯度的间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种快速获得大量高纯度的间充质干细胞的方法，该方法包括：（1）、提供胚胎干细胞悬浮液，其中悬浮液中包括拟胚体（EB）培养液； （2）、将胚胎干细胞悬浮液接种到第一细胞培养皿中的第一初始位置，培养2-3天后； （3）、将初始位置的胚胎干细胞悬浮液从第一培养皿中移除，并放入第二培养皿中第二初始位置培养2-5天，其中，继续培养第一细胞培养皿中的细胞直至80-90%以上的汇合度；循环步骤（2）和（3）。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，第二次初始培养的时间为2天。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，第一次初始培养的时间为2天。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，培养的细胞汇合度为90%以上。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括胚胎干细胞悬浮液的准备步骤，包括如下步骤：6孔板中培养的胚胎干细胞用中性蛋白酶在37度培养箱消化5分钟后，弃去中性蛋白酶，加入2ml DMEM培养液，使用1ml无菌注射器的推杆刮掉ESC的克隆，将细胞悬液加入15ml离心管中，静置5分钟。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，将静置的离心管中的上清液去掉，加入2ml 拟胚体（EB）培养液，其具体组分包括：DMEM，KSR，L-glutaine和NEAA，用5ml血清管重悬细胞，加入超低吸附6孔板中，二氧化碳培养箱中培养6天，每两天更换培养液一次。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，在循环步骤中，可以从第二培养皿中取出第二初始位子的拟胚体（EB）培养液的细胞放入第第三培养皿的第三初始位置进行培养，同时对第二培养皿中剩余的细胞进行培养直至90%以上的汇合度。

8.一种快速获得大量高纯度的间充质干细胞的方法，该方法包括如下步骤：（1）、6孔板中培养的胚胎干细胞用中性蛋白酶在37度培养箱消化5分钟后，弃去中性蛋白酶，加入2mlDMEM培养液，使用1ml无菌注射器的推杆刮掉ESC的克隆，将细胞悬液加入15ml离心管中，静置5分钟； （2）、弃上清，加入2ml 拟胚体（EB）培养液，其中，培养的组成为质量百分比为78%DMEM,20%KSR,1% L-glutamine,1%NEAA，用5ml血清管重悬细胞，加入超低吸附6孔板中（二氧化碳培养箱中培养6天，每两天更换培养液一次； （3）、第6天将形成的EB接种到6孔板中，培养2天后，EB周围会爬出类似MSC的细胞，再过3天有大量MSC爬出，将EB中心的部分用移液器挑出来放入另一个6孔板中培养，剩下的MSC细胞继续培养至90%的汇合度； （4）、EB中心部分在新的培养皿里继续生长，5天后周围又长出新的MSC，将EB中心部分再次挑出，放入新的培养皿培养，剩下的MSC继续培养至90%的汇合度； （5）、连续挑出EB中心部分可省时省力地连续获得MSC。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的中心位置是指指EB中心未分化的部分，EB培养几天后边缘的细胞会分化，中心的细胞没有分化，取走未分化的部分，留下分化后的细胞，每次取走的未分化部分的大小随着取走次数的增加会逐渐减小，因为分化的细胞越来越多，未分化的细胞越来越少。