[发明专利]一种利用南美白对虾血淋巴直接PCR的方法

说明书

本发明公开了一种利用南美白对虾血淋巴直接PCR的方法，该方法由1.抗凝剂配制；2.血淋巴采集及预处理；3.PCR处理三部分组成，其特点为操作简单、成本低廉、安全无毒，该方法不仅省去了提取DNA的繁琐步骤而且不会造成对对虾亲本的伤害，符合现代生物学要求。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种对虾的PCR方法。

背景技术

南美白对虾, 因其产量高，养殖周期短，出肉率高，味道鲜美等特点，发展成为世界性的经济甲壳类养殖品种，自我国引进白对虾以来，积极培育具有自主知识产权的优良新品种，然而国内对虾品种的培育均依赖于传统选育和杂交手段进行，培育的品种无法和国外进口品种相媲美。因此，利用分子辅助标记育种的手段，培育安全、高效且杂交子代性状可控的优良新品种是国内南美白对虾长足发展的必由之路。在这一过程中，快速获取大样本的遗传数据就显得至关重要，而传统的DNA提取方法在上千样本的提取中是一种费时费力且对人体有害的低效手段。

聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，在生物学上，聚合酶链式反应英文简称为PCR，PCR的最大特点是能利用微量的DNA放大获得实验要求的目的片段。现有的南美白对虾的分子辅助标记育种均是先在提取DNA基础上再进行聚合酶链式反应，利用PCR试剂盒来进行的，但单个样本的PCR扩增成本高达20-50元，这在大样本筛选的工作无疑会大量增加实验成本。此外在分子辅助标记育种中，无创或者低伤害采集繁殖亲本的组织进行遗传分析是技术人员一直想要克服的问题，但现有技术依然是采集对虾步足进行DNA提取，这无疑会对对虾亲本造成较大伤害。

发明内容

本发明的目的在于解决现有南美白对虾PCR技术成本高、费时费力且对亲本伤害较大的问题，提供了一种利用南美白对虾血淋巴直接PCR的方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：血淋巴是动物血腔内流动的血样液体 ，具有生物学遗传特性。本发明用南美白对虾的血淋巴代替步足或其他组织进行DNA提取，通过微创方法直接抽取南美白对虾血淋巴，然后对南美白对虾血淋巴进行抗凝处理，以防其冷却凝固，最后进行南美白对虾血淋巴的PCR处理，提取和复制南美白对虾DNA。

具体来说，一种利用南美白对虾血淋巴直接PCR的方法，包括如下步骤：

1.抗凝剂配制

分别称取EDTA2.92g、葡萄糖20.67 g、氯化钠19.25 g和柠檬酸钠8.22g，加入1L超纯水中，并充分混合溶解，混合溶解后用0.22um的细菌过滤器过滤备用。

2.血淋巴采集及预处理

a.用规格为1ml注射器以45°角对准对虾第六体节与尾节连接处的基膜处，插入基膜4mm抽取20ul血淋巴。

b.将抽取的20ul血淋巴注射入200ul PCR管中，并加上30ul步骤1中的抗凝剂吹打混匀，混匀后用掌上离心机进行快速离心处理。离心后加入70%乙醇轻微洗涤后，倒掉乙醇，加入10ul去离子水进行细胞重悬后备用。

3.PCR处理

取1ul上述已处理好血淋巴样本作为PCR处理的样板，输入程序进行PCR处理，基因检测正反向引物：0.5ul（10um/ul），2x PCR MIX：10ul，ddH2O：8ul。

作为优选，上述的一种利用南美白对虾血淋巴直接PCR的方法，步骤2-b中，离心处理的时间为15s。

作为优选，上述的一种利用南美白对虾血淋巴直接PCR的方法，步骤3中，PCR的程序为: