[发明专利]用于甄别半滑舌鳎真伪雄鱼性的荧光分子标记和检测方法

说明书

本发明为用于甄别半滑舌鳎真伪雄鱼性的荧光分子标记和方法。分子标记的设计和检测是基于五引物扩增阻碍突变体系（即PARMS，Penta‑primer amplification refractory mutation system)。利用半滑舌鳎Z/W性染色体DNA序列差异确认了Z/W性染色体间DNA序列上的SNP位点（命名为SNP_chr_8935925_C_T）。对60条性别已知样本的高通量qPCR实验验证表明该分子标记可成功鉴定所有样本中的真伪雄鱼。该标记和相应的检测方法在保证准确率的前提下，使操作更快捷，成本更低廉，检出率更高，并可实现高通量检测。

技术领域

本发明属于水产生物技术中的海水鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术领域，是一种基于半滑舌鳎性染色体Z/W之间的SNP位点开发出来的能甄别其性别的共显性高通量荧光分子标记。

背景技术

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)属鲽形目、舌鳎科、舌鳎属，是我国海域特有的一种暖温性近海大型底层鱼类，主要分布于以黄海、渤海的沿岸地区。由于半滑舌鳎自然资源量少，味鲜鲜美，口感爽滑，营养丰富，因此具有广阔的养殖前景，是重要的名贵海水养殖鱼类。半滑舌鳎作为比目鱼，雌性个体的生长速率是雄性个体的3倍以上(陈松林等，2013)，而雄鱼具有生长缓慢、个体体型小的特点，降低了半滑舌鳎的养殖产量，同时使养殖成本增加。半滑舌鳎养成中雄鱼甚至可以达到80％—90％。研究发现在80％—90％比例的雄鱼中有一部分是伪雄鱼。有研究表明半滑舌鳎性别决定机制为性染色体Z和W，其中同型染色体ZZ为遗传雄性个体，异型染色体ZW型为遗传雌性个体(Zhuang et al.,2006；周丽青等,2005)。半滑舌鳎正常雄鱼具有ZZ型的染色体，正常雌鱼具有ZW型的染色体。而伪雄鱼遗传的是雌性染色体，基因型都是ZW型。但从其体貌特征和生殖器官上均表现为雄性特征，也可以像雄鱼一样产生可育精子和繁育后代。而且如果用伪雄鱼作为父本，那么后代也会遗传父本的特征成为伪雄鱼。这样通过逐代积累，就导致了半滑舌鳎养殖群体中生理雌性的比例的失衡(即雄鱼越来越多，雌鱼越来越少)，从而严重影响半滑舌鳎养殖产量。因此，对快速鉴定半滑舌鳎性别尤其是真伪雄鱼甄别的高效分子标记和检测方法的开发，对其遗传性别鉴定及生产养殖，具有重要的科学意义和应用价值。

在半滑舌鳎性别特异分子标记筛选和遗传性别鉴定方面，前人通过AFLP(amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性)标记技术分离到半滑舌鳎雌性特异AFLP标记(Chen et al.，2007)，由于AFLP标记是显性遗传，应用中不能区分ZW雌性和WW超雌个体，难以避免假阴性的结果，从而对ZZ雄鱼和ZW雌鱼产生误判。通过对半滑舌鳎共显性性别特异微卫星scaffold68-2标记筛选(刘洋等，2014)，可针对共显性性别特异标记位点设计引物对半滑舌鳎遗传性别进行鉴定，但实际应用中微卫星内INDEL短(小于50bp)，导致来自Z染色体和W染色体的两种PCR扩增产物片段长度差异较小，对在凝胶电泳判定其长短时造成不小的困难。同时该技术检测中需用浓度为4％的琼脂糖凝胶以助于区分小的长度差异的条带(如小于50bp)，而高浓度的琼脂糖又不易配制、电泳用时长、费用高等问题，这都进一步限制了该方法的推广。

因此，发明一种基于SNP的共显性能甄别半滑舌鳎性别包括真伪雄鱼的荧光分子标记来解决上述问题尤为必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于甄别半滑舌鳎真伪雄鱼性的荧光分子标记和检测方法，利用半滑舌鳎性别特异性SNP位点分型，来解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案，包括以下步骤：

步骤一：下载已公开无知识产权的公用ZW染色体基因组序列；

步骤二：在寻找到的ZW染色体同源等位基因序列进行比对分析，筛选出能区分ZW性染色体的候选SNP位点；