[发明专利]基于KASP技术检测MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶SNP突变的方法

说明书

本发明公开了基于KASP技术检测MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶SNP突变的方法，包括SNP突变标记点，所述方法包括如下步骤：步骤一：根据MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶的基因DNA序列和SNP突变标记点设计特异引物；步骤二，口腔上皮细胞样本采集和DNA纯化：步骤三，配制KASP反应体系：反应体系的成分包括5ulKASPMasterMixture、SNP突变标记点设计的0.3ul特异引物、2.5ul浓度为10‑25ng/ul的DNA，2.2ul无酶水，反应体系混匀后使为10ul；本发明可适用于中、高通量商业化基因检测应用，也可以应用少量位点重复实验，有很强灵活性。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及基于竞争性等位基因特异性PCR技术检测亚甲基四氢叶酸还原酶SNP突变的方法。

背景技术

MTHFR为5,10-methylenetetrahydrofolatereductase，亚甲基四氢叶酸还原酶，主要作用是在叶酸代谢通路中将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸。5-甲基四氢叶酸可以进一步进入甲基传递通路，通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接为DNA甲基化和蛋白质甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸水平保持在一个较低的水平。此外叶酸的中间代谢产物在核苷酸合成过程中也有重要的作用，通过一碳单位代谢为嘌呤环的形成提供碳原子。MTHFR基因的缺陷将导致机体多个基础生化过程的紊乱，包括细胞周期调控、DNA复制、DNA以及蛋白质甲基化修饰等，并进而引发神经管缺陷、癌症、心脑血管疾病等多种病症。MTHFR基因的缺陷对孕妇人群会引起神经管缺陷、先天性心脏病、唇腭裂、妊娠期高血压疾病，自发性流产。与疾病相关的MTHFR基因SNP位点主要有两种：C677T(rs1801133)、A1298C(rs1801131)。

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸变异而引起的一种DNA序列多态性。它在生物遗传变异中广泛存在，据统计已知多态性中90％以上为SNP。SNP数量多、分布广泛、遗传稳定性好、二等位基因型等特点，适于快速、规模化筛查，易于基因分型，在基因突变检测中广泛应用。

适用于SNP检测的方法主要有聚丙烯凝胶酶切电泳、Taqman探针、SNP基因芯片和一代测序、竞争性等位基因PCR(KompetitiveAlleleSpecificPCR，KASP)。聚丙烯凝胶酶切电泳需要接触聚丙烯和核酸染料EB，对人体有潜在的伤害，并对环境可能造成污染。一代测序准确度高，但价格昂贵，不适合大批量样本检测，而Taqman探针适合做大量样本，但也价格昂贵。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种基于KASP技术检测MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶SNP突变的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

基于KASP技术检测MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶SNP突变的方法，包括SNP突变标记点设计的特异引物序列，所述方法包括如下步骤：

步骤一：根据MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶的基因DNA序列和SNP突变标记点设计特异引物；

步骤二，口腔上皮细胞样本采集和DNA纯化，其包括如下几个操作次序：

基于KASP技术检测MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶SNP突变的方法，包括SNP突变标记点，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

步骤一：根据MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶的基因DNA序列和SNP突变标记点设计特异引物；

步骤二，口腔上皮细胞样本采集和DNA纯化，其包括如下几个操作次序：

A、一次性采样拭子头分别在口腔左右两侧内壁黏膜上下用力大幅度擦拭30次，刮取口腔上皮细胞，用剪刀把拭子头其杆上剪下至1.5ml离心管里；