[发明专利]受核苷酸片段引导具有特异核酸内切酶活性的PIWI蛋白

说明书

本发明提供一种受磷酸化小DNA引导的具有核酸内切酶活性的核酸酶，本发明的具有PIWI结构域的核酸酶发挥的具体作用是对RNA进行剪切。尽管来自嗜热菌PIWI能对DNA双链进行剪切，但需要大于65℃才能发挥作用。本发明发现的PIWI能够在37℃的温和条件下对DNA双链进行剪切，从而更方便进行基因工程操作。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种受磷酸化核苷酸片段(DNA/RNA)引导具有核酸内切酶活性的PIWI蛋白。

背景技术

PIWI结构域是Argonaute蛋白的组成部分，通常位于Argonaute蛋白的C末端。PIWI家族包含一个保守结构，由位于中间的PAZ结构域和位于C末端的PIWI结构域组成。PIWI结构域有一个的类似RNaseH的折叠结构，包含具有催化活性的四聚体Asp-Glu-Asp-X(X代表Asp，或Asn，或His)。Ago蛋白与核苷酸的作用主要依赖PIWI上的氨基酸残基与发挥引导作用的DNA/RNA的磷酸二酯碱结合，对目标链进行剪切。在有些Argonaute蛋白中，PIWI中具有剪切活性的氨基酸发生突变，导致Argonaute蛋白内切核酸酶活性缺失。

目前所报道的PIWI结构域基本只作用于RNA，作用于DNA的报道仅有来自嗜热菌的Argonaute蛋白，在75℃作用下才能对DNA发生剪切作用。而本发明所提供的PIWI结构域，在37℃能够对DNA发生剪切作用，且受到磷酸化小DNA的引导能够进行定点切割，从而能够应用于基因的定点编辑。

依据PIWI的核酸内切酶功能，该酶可能参与了细菌的免疫防御。特别是PIWI的N端含有一个RecJ的结构域，该结构域主要参与基因组的重组和修复。而PIWI和RecJ偶联在一起，可能保护染色体免受外源物质的破坏，执行了保护染色体免受伤害，是细菌免疫的最后一道防线。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种磷酸化短核苷酸片段(DNA/RNA)引导，且具有核酸内切酶活性的核酸酶、编码基因、载体、工程菌及应用，应用于基因的编辑

本发明提供的是一种细菌的PIWI结构域的核酸酶，能够结合不同的磷酸化的小DNA/RNA,对多个特定位点发挥核酸内切酶作用，进行基因编辑

本发明首先提供一种具有PIWI结构域的核酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

MKQLAPFGVSNPTPKIMLQQANIGEMKKIGSEANHLKIQFKQNGSSLDGIGFHFGYVYEQMSVQDRVSAVGTLSINEWNGHIKPQLMIEDIAVTDWQLFDWRSVQKLRLEDKLKLISLPTQYLIAFNDETKVKLKLENEQIWTREQLSHIDSFENAAVVLLDLPASEQEIKQLFADKGRPSQIFCLFYQEEDSFFSASPNRETFKWFYAFLRKQKKFNLNEQGMKLISYKGWSKESVKFMVEVFVELNFIRQENGWLIIEENPEKKSLTDSVAFQRKENQRTLENDFVYSSFEHLKQLFTTIFEQNTNESTIKETV；

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽片段或其变体，只要该多片段或多肽变体与前述氨基酸具有相似或相同的活性位点，均属于本发明保护范围之列

本发明的具有PIWI结构域的核酸酶，在受磷酸化的小DNA/RNA引导下能作为核酸内切酶来使用，所述核酸为超螺旋DNA，线性双链DNA，线性单链DNA，环状单链DNA中的任一种，

所述小DNA/RNA，其长度为10-40bp，

所述的小DNA/RNA可以是与剪切目标DNA链匹配的单链片段或双链片段；

本发明还提供上述氨基酸序列为SEQ ID NO:1的核酸酶的制备方法，包括如下的步骤：

1)构建定点切割核酸酶的重组表达质粒