[发明专利]一种用于筛选噬菌体的前处理方法

说明书

本发明公开一种用于筛选噬菌体的前处理方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行：首先，向处于生长对数期的目标菌株发酵液中按照一定的质量百分比添加海藻酸钠、聚二甲基硅氧烷、低聚异麦芽糖和钠基膨润土，搅拌混匀至完全溶解，然后，利用滴液发生器将上述溶液滴至氯化钙溶液中形成微球，回收微球并将其置于真空冷冻干燥机中干燥，将冻干微球置于噬菌体分离原液中孵育，同时使用磁力搅拌器保持噬菌体分离原液的流动性，回收微球，并将微球置于研钵中，向研钵中加入PBS溶液，研磨至微球溶解在PBS溶液中，将溶解后的溶液过0.22微米孔径滤膜，收集滤过液，滤过液即为为目标菌株的噬菌体富集液。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种用于筛选噬菌体的前处理方法。

背景技术

噬菌体（Bacteriophage）是一类寄生于细菌、霉形体、螺旋体、放线菌以及蓝细菌等病毒，亦称细菌病毒。在自然界分布极广，凡是有上述各类微生物的地方，都有相应种类噬菌体的存在，其数目与寄主的数量成正比。噬菌体是1915年Frederick W. Twort及1917年Felix d’Herelle 分别发现的，曾被称为Twort-d’Herelle现象，之后，国外的研究者进行了探索性研究工作。二十世纪四十年代抗生素的迅速发展，有关噬菌体治疗方面的研究基本处于停滞状态。直到二十世纪末，基于抗生素的滥用而产生耐药菌株和药物残留等问题日益加重，噬菌体的治疗技术又重新受到人们的重视。

噬菌体能与宿主发生特异性结合并注入其DNA，如能发生增殖并使宿主细菌迅速裂解引起溶菌反应的噬菌体，称为裂解性或毒性噬菌体；与细菌DNA同步复制，并随细菌的分裂而传给后代，不会导致细菌裂解，但在外界条件的刺激下，可从宿主DNA中剪接出来，利用宿主细胞内的酶系和蛋白进行自我复制，引起溶菌反应而释放出噬菌体，称为溶源性噬菌体。由于溶源性细菌能抵抗相应烈性噬菌体的溶菌作用，不适合用与持续的噬菌体治疗，所以噬菌体治疗必须选用烈性噬菌体。裂解性噬菌体在溶解其特异性宿主细菌时十分有效，而且其杀死细菌的机制与抗生素不同，已成为目前抗生素替代品中的研究热点。

目前，噬菌体的筛选工作已经成为噬菌体领域发展的瓶颈问题，特别是对于一些稀有的特殊目标菌株如古细菌、极端条件菌株等，噬菌体的筛选工作异常艰难。另外，噬菌体的筛选效率决定了噬菌体制剂的研发效率，是一款噬菌体制剂有效性的决定因素。现在最常用的噬菌体筛选方案是通过将采集的噬菌体分离原液直接与处于对数生长期的菌液进行混合，使样品中的噬菌体颗粒与其目标菌株结合后进入噬菌体繁殖复制周期，从而达到富集噬菌体的目的。然而，应用该方法进行筛选时，常常由于受到噬菌体分离液体积的限制，无法同时进行多株宿主菌的噬菌体筛选工作。同时，如果降低单次富集的噬菌体分离液的体积则会大大降低噬菌体颗粒与宿主菌接触的概率，降低筛出率。因此，为了满足噬菌体制剂研发过程中大规模高效率的噬菌体筛选工作，亟需一种高通量的噬菌体筛选方案，在不降低筛出率的前提下，提高噬菌体分离液的利用效率，从而提高噬菌体的筛选通量。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种可大大提高噬菌体筛选的通量，提高噬菌体分离原液的利用率，缩短研发周期，加快筛选进程的处理方法。

本发明的技术解决方案是：一种用于筛选噬菌体的前处理方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行：

首先，向处于生长对数期的目标菌株发酵液中按照质量百分比添加1~1.5%的海藻酸钠、0.1~0.5%的聚二甲基硅氧烷、1~2%的低聚异麦芽糖和1~5%的钠基膨润土，其中钠基膨润土的蒙脱石含量≥85%，搅拌混匀至完全溶解，

然后，利用滴液发生器将上述溶液滴至1~2%（w/w）的氯化钙溶液中形成微球，并保持微球粒径大小在3~5 mm，从氯化钙溶液中回收微球并将其置于真空冷冻干燥机中，干燥至含水量低于1%，

将冻干微球置于噬菌体分离原液中，冻干微球与噬菌体分离原液的质量体积比为1:1g/ml，在28~37℃的条件下孵育12小时，同时使用磁力搅拌器保持噬菌体分离原液的流动性，