[发明专利]一种纯化重组鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的马立克氏病病毒CVI988株的方法

权利要求书

1.一种筛选高效表达外源蛋白的重组疫苗株的方法，其特征在于，其方法包括如下步骤：

(1)、将感染重组疫苗的种子毒的鸡胚成纤维细胞在96孔细胞板上进行有限稀释；

(2)、将步骤(1)的细胞板进行培养后，根据细胞病变状况，选择只有单个空斑的细胞孔以胰酶消化，然后将获得的细胞一分为二；

(3)、将步骤(2)获得的细胞的其中一部分接种于6孔板预先制备的鸡胚成纤维细胞中，另一部分经有限稀释后接种至96孔细胞板的鸡胚成纤维细胞中，培养至出现空斑；

(4)、用固定液将6孔板中鸡胚成纤维细胞固定，以抗外源蛋白的单克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶HRP标记的结合单克隆抗体的二抗进行结合反应，再进行3－氨基－9－乙基咔唑底物显色试剂原位染色；

(5)、选取步骤(4)试验的6孔板90％以上空斑为外源蛋白表达阳性孔，即空斑被染成深褐色对应的96孔板进行(2)-(4)的纯化，直至筛选出高效表达外源蛋白蛋白的细胞克隆，即6孔板中的空斑100％被染成深褐色，即对应的96孔板的重组疫苗株即为高效表达外源蛋白的重组疫苗株。

2.一种纯化重组鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的马立克氏病病毒CVI988株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将感染重组鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的马立克氏病病毒CVI988株的鸡胚成纤维细胞在96孔细胞板上进行有限稀释；

S2、将步骤S1的细胞板进行培养后，根据细胞病变状况，选择只有单个空斑的细胞孔以胰酶消化，然后将获得的细胞一分为二；

S3、将步骤S2获得的细胞用胰酶消化稀释后的其中一部分接种于6孔板预先制备的鸡胚成纤维细胞中，另一部分经有限稀释后接种至96孔细胞板的鸡胚成纤维细胞中，培养至出现空斑；

S4、将固定液加入6孔板中进行固定，以抗IBDV VP2单克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗进行结合反应，再进行3－氨基－9－乙基咔唑底物显色试剂原位染色；

S5、选取步骤S4试验的6孔板90％以上空斑为IBDV VP2蛋白表达阳性孔，即空斑被染成深褐色，对应的96孔板的重组疫苗株进行S2-S4的纯化，直至筛选出高效表达IBDV VP2蛋白的细胞克隆，即6孔板中的空斑100％被染成深褐色，即对应的96孔板的重组疫苗株即为高效表达重组鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的马立克氏病病毒CVI988株的疫苗株。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤S1和步骤S3中，所述有限稀释为将重组鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的马立克氏病病毒CVI988株按0.65pfu/孔稀释。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤S2和S3中，所述培养为在37℃的CO₂培养箱中培养3～5天。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤S4中，所述固定液为预冷的体积比为1:1的丙酮和甲醇的混合液，固定时间为5～10分钟。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤S4中，固定后，先弃去固定液，用PBS清洗3遍，加入含5％小牛血清的PBST的封闭液，室温封闭1小时，PBS洗涤3遍后，再加入所述抗IBDV VP2单克隆抗体。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤S4中，加入所述抗IBDV VP2单克隆抗体后，室温作用1小时，再以PBS洗涤3遍后，以封闭液稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG进行结合反应1小时，重复PBS洗涤过程后，再进行3－氨基－9－乙基咔唑底物显色试剂原位染色。