[发明专利]校正高通量测序原核与真核微生物基因序列读取数的方法及所用菌

权利要求书

1.校正菌株E.coli WYL，其特征是：为大肠杆菌Escherichia coli WYL，保藏编号为CCTCC NO:M 2017770。

2.利用如权利要求1所述的校正菌株E.coli WYL进行的校正高通量测序原核与真核微生物基因序列读取数的方法，其特征是依次包括以下步骤：

1)、将校正菌株E.coli WYL，重悬于无菌水中，得菌悬液；

2)、校正菌株的添加：

将步骤1)所得的菌悬液加入至作为待测样品的土壤中，添加浓度为10⁵-10⁷cells g^-1，冰浴环境下搅拌混匀；

3)、样本原核与真核微生物高通量测序：

提取土壤DNA，分别采用原核微生物通用引物515F/806R和真核微生物通用引物ITS-F/ITS-R对原核微生物16S rRNA基因与真核微生物ITS基因进行高通量测序，从而获得原核与真核微生物群落结构分类组成信息及其测序读取数量；

515F 5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3’

806R 5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3’

ITS-F 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

ITS-R 5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’

4)、测序数据过滤与注释：

将步骤3)所得的高通量测序数据采用QIIME软件进行质控与过滤；正向与反向测序结果采用FLASH软件进行拼接；采用UPARSE软件将优质序列按97％的相似度归为一个OTU；将校正菌株中人工设计515F/806R及ITS-F/R所对应碱基信息分别添加进SILVA数据库及Unite数据库，采用包含校正菌株碱基信息的SILVA数据库及Unite数据库分别对原核微生物及真核微生物OTU进行注释；

5)、校正计算：

通过对单个样品中原核微生物16S rRNA基因及真核微生物ITS基因的高通量测序，获得各分类水平及各分类单元的原核微生物群落测得序列数量组成(Taxon_Pj，j＝1,2,3,……,n)及真核微生物群落测得序列数量组成(Taxon_Ej，j＝1,2,3,……,n)，且原核与真核微生物群落中均包含校正菌株的测得序列数量(AS_P和AS_E)；通过校正菌株在原核与真核微生物群落中的16S rRNA基因与ITS基因读取数量的比值获得校正系数并将真核微生物各分类单元ITS基因读取数量分别乘以ρ，即获得真核微生物群落各分类单元的校正读取数(Taxon_Ej×ρ，j＝1,2,3,……,n)；

6)、原核微生物群落(Taxon_Pj，j＝1,2,3,……,n)测得序列数量与校正后的真核微生物群落(Taxon_Ej_A×ρ1，j＝1,2,3,……,n)测得序列数量，即组成土壤样品微生物区系各分类单元总测得序列数量组成。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是：步骤1)所得的菌悬液为OD_600nm＝0.9～1.1。