[发明专利]猪流行性腹泻特异性SIgA抗体ELISA检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开猪流行性腹泻特异性SIgA抗体ELISA检测试剂盒及其应用，检测试剂盒包括重组蛋白S1D。本发明还公开基于S1D蛋白检测鼻液和唾液中猪流行性腹泻病毒SIgA的间接ELISA方法，通过基因克隆表达技术成功构建重组质粒，蛋白纯化亲和层析技术获取猪流行性腹泻病毒S1D蛋白，以S1D蛋白为包被抗原建立间接ELISA检测黏液中猪流行性腹泻病毒SIgA抗体方法。可用于猪群中猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体检测，判断猪群中猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体水平。该方法具有较好的特异性和敏感性，可应用于猪流行性腹泻病毒SIgA抗体的临床检测及黏膜免疫评价。本发明操作简单，应用范围广。

技术领域

本发明属于兽医生物技术领域，具体涉及猪流行性腹泻特异性SIgA抗体ELISA检测试剂盒及其应用，本发明基于猪流行性腹泻病毒S1D蛋白为包被抗原，建立检测鼻液 和唾液中猪流行性腹泻病毒SIgA抗体的间接ELISA方法。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种以猪水样腹泻、呕吐、脱水为特征的急性肠 道传染病。该病对哺乳仔猪危害最大，呈现高发病率、高死亡率等特点，其他年龄段的 猪也易感染，且可持续带毒。目前，PED在全世界广泛流行和迅速传播，给各国养猪业带来了巨大的经济损失。

PEDV为冠状病毒，其病毒粒子共包含4个结构蛋白：纤突蛋白(S)、囊膜蛋白(E)、膜蛋白(M)以及核衣壳蛋白(N)。其中S蛋白是位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白，病 毒粒子可以通过S蛋白与细胞表面受体结合，借助细胞膜融合机制从而侵入宿主细胞， 该蛋白还可以激发感染宿主产生中和抗体，在病毒的预防机制中发挥着重要的生物学作 用。根据其不同部位的功能，分为具有识别结合宿主特异性受体位点的S1亚基(1～ 789aa)和介导病毒与宿主细胞膜融合的S2亚基(790～1383aa)。其中，S1亚基的S1D 区(534-789aa)，携带了PEDV主要的B细胞抗原表位，能够给动物机体提供免疫保 护作用。因此选取该区域基因构建表达载体，表达的蛋白可以作为良好的制备抗体检测 试剂盒的备选包被抗原。

PEDV主要通过消化道入侵并主要引起小肠发生病变。通过黏膜免疫可直接切断PEDV的主要入侵途径，有效防止PED的发生。黏膜免疫的主要效应因子是分泌型IgA(Secretory immunoglobulin A，SIgA)，主要存在于消化道，呼吸道以及生殖道黏液中， 其具有多种生物学功能，如抑制病原体粘附、抗病毒感染、免疫清除等，尤其SIgA通 过与病毒结合并能阻止病毒的入侵受到高度关注。SIgA已成为检测和判断黏膜免疫和 抗病毒的重要指标。目前，口服免疫和鼻腔免疫(黏膜免疫)是预防PED的最佳免疫 途径。但现在应用的检测主要针对血清IgG和乳汁IgA，少量检测肠道黏液IgA，而且 所用的ELISA方法主要通过PEDV全病毒包被。至今还没有评价黏液中PEDV特异性 抗体的标准，因此限制了黏膜免疫的应用。

试验表明血清中IgG的抗体效价不能代表PEDV黏膜免疫水平，而乳汁的采集比较繁琐困难，且有一定的时间局限性；肠道黏液的采集需要处死动物，不利于活体检测， 采集更为繁琐局限。相比之下，鼻液和唾液采集方便，无时间局限性，且不同黏膜处 SIgA水平具有一定相关性。此外PEDV全病毒包被因其病毒的扩繁和纯化操作复杂， 试验要求高、成本昂贵、耗时长产率低，不能被广泛应用，从而限制了PEDV抗体的检 测。大肠杆菌原核表达系统简便，可广泛应用。因此，本发明建立了一种检测鼻液和唾 液中PEDV特异性SIgA抗体水平的方法，从而评估猪群PEDV黏膜免疫力水平。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了猪流行性腹泻特异性SIgA抗体ELISA检测试剂盒。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种基于猪流行性腹泻病毒S1D蛋白建立的间接ELISA检测方法，可用于猪群中黏膜处猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体检测， 以此判断猪群中特异性黏膜免疫水平。