[发明专利]田鼠巴贝斯虫GPI10基因及其编码的蛋白和应用

说明书

本发明公开了一种田鼠巴贝斯虫GPI10基因，该基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明还公开了编码所述田鼠巴贝斯虫GPI10基因的重组蛋白以及抗田鼠巴贝斯虫GPI10蛋白的多克隆抗体，该重组蛋白具有如序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。田鼠巴贝斯虫GPI10重组蛋白具有良好的免疫原性，为田鼠巴贝斯虫的检测提供了良好的特异性抗原，且可以使用多克隆抗体检测出田鼠巴贝斯虫体，可作为诊断抗原的候选分子。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及田鼠巴贝斯虫GPI10基因及其编码的蛋白和应用。

背景技术

田鼠巴贝斯虫是一种经丹敏硬蜱传播的顶复门原虫，也是一种重要的血液原虫，可感染小型啮齿类动物(如白足鼠等)或者人。自1957年从南斯拉夫报道第一例人感染巴贝斯虫以来，全球已有数千例人感染巴贝斯虫报道，人兽共患巴贝斯虫病例逐年上升。由于缺乏医学意识和临床诊断手段，人类巴贝斯虫病在很大程度上被大众所忽视。

田鼠巴贝斯虫感染往往呈亚临床症状，严重感染时可导致高热、贫血甚至死亡，对免疫力低下和免疫功能缺陷的个体(如脾脏摘除患者，艾滋病患者)甚可引起如呼吸窘迫或贫血引起的肾功能衰竭。此外，无症状献血者常常不知道自己的感染情况，而目前血液中心对献血者血液不进行巴贝斯虫病检测，从而为后续血液的使用带来了很大的安全隐患。因此尽早、尽快地诊断田鼠巴贝斯虫的意义非常重大。

目前，田鼠巴贝斯虫病检测方法主要有血涂片染色镜检、ELISA(酶联免疫吸附实验)、IFA(间接免疫荧光试验)、NAT(核酸检测)如PCR(多聚酶链式反应)、LAMP(环介导等温扩增技术)等。血涂片染色镜检法虽操作简单、设备需求低，但耗时耗力，且易出现漏检。常规PCR、荧光定量PCR及克隆测序等分子生物学方法，具有较高的特异性和灵敏性，但对检测人员的技术和实验技能要求高，且需要昂贵的试剂与仪器设备，故较难实现临床上的批量检测。LAMP技术检测简单快速，结果可直接通过肉眼观察，但易出现假阳性，且不易鉴定虫体种类。因此，临床上急需一种良好的分泌抗原以进行田鼠巴贝斯虫的早期血清学诊断。

GPI(糖基磷脂酰肌醇)锚定化修饰是一种存在于真核生物中的蛋白质翻译后修饰方式，该修饰负责把蛋白质锚定在细胞质膜的外侧。有报道表明在哺乳动物细胞中由于GPI的修饰，其中的相关蛋白质可以与细胞膜的微结构或富含胆固醇和神经节苷脂部分结合，瞬间形成同聚物，同时还可以通过切割GPI部分从细胞膜表面释放。由于具有该类修饰的蛋白质直接暴露在宿主免疫系统中，理论上可以有效引起宿主的免疫保护机制。在原虫中，具备GPI锚定化修饰的蛋白往往与虫体入侵宿主红细胞有关，目前田鼠巴贝斯虫的全基因组测序结果显示，在田鼠巴贝斯虫体内一共存在19种以GPI锚定化修饰为主要特征的蛋白质，本发明所述田鼠巴贝斯虫GPI10基因便为其中一种。申请人通过蛋白免疫印迹法发现，在田鼠巴贝斯虫所有GPI蛋白中GPI10基因所表达的重组蛋白具备良好的反应原性，因此选择田鼠巴贝斯虫的GPI10蛋白以期作为一种新的诊断标识。

发明内容

本发明的第一个目的是从田鼠巴贝斯虫中获得GPI10基因。

本发明的第二个目的是将所述田鼠巴贝斯虫基因在大肠杆菌原核表达系统中表达并获得重组蛋白(rBmGPI10)。

本发明的第三个目的是使用所述重组蛋白制备多克隆抗体。

本发明的第四个目的是提供多克隆抗体的应用。

本发明的技术方案如下：

(1)使用血液基因组提取试剂盒，以感染田鼠巴贝斯虫的昆明鼠血液为样本提取田鼠巴贝斯虫基因组DNA，随后以田鼠巴贝斯虫基因组DNA为模板，经PCR得到田鼠巴贝斯虫GPI10基因，其DNA序列的开放阅读框(ORF)如序列表SEQ ID NO：1所示。