[发明专利]一种多重PCR引物设计方法

说明书

本发明公开一种多重PCR引物设计方法，其包括步骤：A、获取目标DNA序列的原始序列；B、对目标DNA序列进行PCR引物设计，生成各位点的候选引物；C、对各位点的候选引物进行过滤，将末端6bp相似度高的候选引物丢弃，筛选出合格的候选引物；D、对每一位点的候选引物进行选择，寻找局部最优解，使各位点引物间形成引物二聚体的可能性最低，然后将所选择的各位点的目标引物进行组合，得到最终的多重PCR引物。本发明基于Primer3软件，对多个位点进行PCR引物设计，能明显有效减少非特异性扩增的情况，可设计出特异性强、各个目标位点均一性好的多重PCR引物。

技术领域

本发明涉及PCR引物设计领域，尤其涉及一种多重PCR引物设计方法。

背景技术

PCR(聚合酶链式反应)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。

Primer3是现在最广泛被使用的开源的PCR引物设计软件。它最基本的功能包括设计PCR引物和设计杂交探针，虽然它具有免费、开源、跨平台等优点，但它一次只能对一个目标序列进行设计引物，而且不能回避单核苷酸高频多态性位点，不能评估引物的特异性和计算简并碱基的计算；不能识别序列相距较近的目标序列并设计兼并引物；不能很好的对多条目标基因序列设计出合理的多重PCR引物。因此，如何提供一种能够减少非特异性扩增，设计出特异性较强的多重PCR引物的多重PCR引物设计方法成为了业界需要解决的问题。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多重PCR引物设计方法，旨在解决现有技术中PCR引物设计方法不能设计合理的多重PCR引物的问题。

本发明的技术方案如下：

一种多重PCR引物设计方法，其中，包括步骤：

A、获取目标DNA序列的原始序列；

B、对目标DNA序列进行PCR引物设计，生成各位点的候选引物；

C、对各位点的候选引物进行过滤，将末端6bp相似度高的候选引物丢弃，筛选出合格的候选引物；

D、对每一位点的候选引物进行选择，寻找局部最优解，使各位点引物间形成引物二聚体的可能性最低，然后将所选择的各位点的目标引物进行组合，得到最终的多重PCR引物。

所述的多重PCR引物设计方法，其中，所述步骤D具体包括：

利用贪婪算法，依次从每一位点的候选引物中选取一条引物，寻找局部最优解，使得各位点所选取的引物间形成引物二聚体的可能性最低。

所述的多重PCR引物设计方法，其中，所述步骤B中，利用Primer3软件进行PCR引物设计。

所述的多重PCR引物设计方法，其中，所述步骤C中，利用blastn工具，对末端6bp相似度高的候选引物进行过滤，降低引物二聚体形成的可能性。

所述的多重PCR引物设计方法，其中，所述末端6bp相似度高的候选引物具体为末端6bp完全一致或者相差一个碱基。

所述的多重PCR引物设计方法，其中，过滤的方式为：仅保留末端6bp完全一致或者相差一个碱基的候选引物中的一条，其余丢弃。

所述的多重PCR引物设计方法，其中，所述步骤D之后还包括：

E、对最终组合出的多重PCR引物进行验证。

所述的多重PCR引物设计方法，其中，所述步骤E具体包括：

对最终组合出的多重PCR引物进行模拟PCR，验证所设计的多重PCR引物的合理性。