[发明专利]标记细胞膜表面及研究细胞-细胞相互作用的酶和方法

说明书

本发明公开了一种标记细胞膜表面及研究细胞‑细胞相互作用的酶和方法，涉及经过基因工程进化的金黄色葡萄球菌分选酶A突变体，这类突变体可以实现临近效应介导的标记反应，基于此可以实现未经基因改造的细胞膜表面的标记，并且可以体内和体外对细胞‑细胞相互作用进行精准捕捉与标记。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别涉及酶促标记技术，具体涉及酶促的细胞膜标记方法，以及利用酶促反应研究、发现细胞-细胞相互作用的方法。

背景技术

细胞膜的标记是研究细胞功能的一项重要手段，通常要完成细胞膜的标记需要对细胞进行基因改造，这也大大限制了细胞膜标记技术的应用。另外，细胞-细胞的相互作用对于生命过程有至关重要的作用，其介导了许多重要的生命过程。然而发现细胞与细胞间的相互作用是相对困难的一件事情，因此开发可以研究/检测细胞-细胞相互作用的技术对于揭示生命过程中的一些信号传导具有很高的意义。

金黄色葡萄球菌分选酶A(Sa-SrtA)是革兰氏阳性菌中普遍存在的一类半胱氨酸转肽酶，典型的，其可以催化底物LPXTG(X代表任意氨基酸)与α-Gly_n(寡聚甘氨酸)之间的连接反应，这一反应因此被命名为分选酶介导的连接反应(Sortase-Mediated Ligation，SML)。同时，分选酶A还可以催化LPXTG与α-Gly之间的反应，然而，相对于其催化α-Gly_n的反应，反应活性更低。

利用分选酶A介导的连接反应，可以实现各种蛋白质的定点标记与偶合。由于野生型分选酶A催化效率较低，基于高通量筛选的定向进化以及理性设计的方法提升分选酶A的活性成为一种必要。Chen等发现了5个点突变P94R、D160N、D165A、K190E和K196T(Chen I.etal.ProcNatl AcadSci USA 2011,108,11399-11404)，可以在一定程度上提升其活性。中国发明专利申请公开文本CN106191015A中发现了另外4个点突变D124G、Y187L、E189R和F200L，获得了金黄色葡萄球菌分选酶A高效突变体。此外，野生型金黄色葡萄球菌分选酶A是一个包含206个氨基酸残基的蛋白酶，截掉氮端25个氨基酸残基的截短体可以在大肠杆菌中高水平、可溶性的表达(Ton-That H.et al.ProcNatl AcadSci USA 1999,96,12424–12429)，因此在现有研究中分选酶A基本上都以这种截短体的形式存在。

发明内容

本发明的目的是基于金黄色葡萄球菌分选酶A的突变体，实现对于未基因改造的细胞膜表面的标记，将金黄色葡萄球菌分选酶A的突变体表达于感兴趣的细胞表面，进而可以实现临近效应介导的标记反应，利用这些特性可以实现对细胞-细胞之间相互作用的检测与发现。

具体的，本发明所提供的金黄色葡萄球菌分选酶A突变体包含以下突变中的一种或多种：P94R、E105K、E108A或E108Q、D124G、D160N、D165A、Y187L、E189R、K190E、K196T、F200L。这些突变体可以更好的催化LPXTG与α-Gly或α-Gly_n之间的连接反应，特别是大大提升了分选酶A催化LPXTG与非典型底物α-Gly的连接效率。

本发明优选的分选酶A突变体是下述突变体之一：

突变体1：P94R/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L

突变体2：P94R/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L

突变体3：

P94R/E105K/E108Q/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L

突变体4：