[发明专利]一种新型结核杆菌融合菌株的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种新型结核杆菌融合菌株的制备方法及其应用，对BCG菌株原生质体和H37Ra菌株原生质体的再生条件进行优化，培养出活性好、生长良好的再生菌株。提供一种制备BCG菌株原生质体和H37Ra菌株原生质体的融合子的方法，其利用电穿孔技术使两种原生质体融合，并探索出其最佳融合条件，同时对融合子进行再生培养，得到生长良好的再生菌株。本发明以BCG和H37Ra两菌株为亲本菌株利用原生质融合技术所成功构建的新型结核病疫苗融合菌株，同时具备卡介苗与H37Ra菌株优良生物特性和遗传性状，探究了此融合菌株的免疫保护效力和安全性，为进一步探讨和研究该融合菌株成为结核病候选疫苗的可能性奠定基础提供依据。

技术领域

本发明属于重组基因、原生质体疫苗技术领域，涉及一种新型结核杆菌融合菌株的制备方法及其应用。

背景技术

结核病是由结分枝核杆菌(Mycobacterium Tuberculosis)感染引起的一种世界性传染病，也是单一致病菌感染导致死亡率最高的感染性疾病。目前结核病依然是全球感染性疾病的头号杀手。世界卫生组织发布的《2017全球结核病报告》公布的新数据显示：2017年世界范围内估计有1040万新发病例，其中男性590万(56％)，女性350万(34％)，儿童100万(34％)。印度、印度尼西亚、中国、尼日利亚、巴基斯坦和南非这六个国家占了新发病例总数的60％。结核病疫情未能获得控制，究其根本原因是缺乏有效的疫苗预防结核病的发生。

控制结核病的有效措施依然在于对结核病的有效预防，目前唯一应用于临床预防结核病的疫苗仍是卡介苗(bacille calmette-guerin，BCG)，它是将牛型结核分枝杆菌不断传递 230代而得到的减毒活菌疫苗，自从1921年问世以来，全球有超过40亿人次接种使用卡介苗每年约有1亿名新生儿使用接种预防，成为世界上应用最广泛的疫苗。卡介苗培养简单，价格低廉，其安全性相对较好，但在长期的应用过程中人们逐渐发现它的缺点和不足：1.WHO 认为卡介苗的接种对于儿童严重结核病如结核性脑膜炎及粟粒型肺结核有较好的预防效果，但对成人结核病并无保护作用，但成年人是结核病的主要传播来源，因此卡介苗接种也不能降低结核病传播。2.保护效力并不稳定，并有相对应用禁忌症及不良反应。研究证实卡介苗对结核病的预防效果在不同地域不同人群差异较大，保护率为0～80％不等，因此有关卡介苗是否有效的争议一直都存在。3.对于先天性免疫低下的儿童及后天获得性免疫力缺陷患者在接种卡介苗后有可能导致严重的并发症或播散性结核病；4.在长期的传代过程中丢失一些重要抗原基因，免疫保护效力降低，另外接种卡介苗后还会对结核病患者的诊断结果产生一定的影响。

传统的卡介苗已经不能满足人类预防结核病的需求，各国研究人员均在不断努力开发新型结核病疫苗。诸多新兴结核病疫苗均处于不同受试阶段，到目前为止仍没有一种疫苗可以成功的替代卡介苗而广泛应用于临床预防。

人型结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株是由人型结核分枝杆菌强毒株H37Rv多次传代培养减毒后获得，其成为结核病疫苗方面具有以下优势：

第一，抗原较BCG完整。

第二，H37Ra在人类巨噬细胞中的繁殖速度低许多，但同时又具有H37Rv菌株的免疫原性能充分活化免疫细胞，且能够长期在宿主体内定植生长，满足活菌疫苗的基本要求。

第三，人类结核病多由人型结核分枝杆菌引起，少数由牛型结核分支杆菌引起，有研究发现卡介苗免疫的动物抵抗牛型结核分枝杆菌的作用强于抵抗人型结核分枝杆菌。H37Ra菌株作为结核病疫苗候选菌株也已经被广泛关注。虽然H37Ra菌株在成为疫苗方面有较好的潜能，但有诸多研究表明其毒力较卡介苗强，单独作为结核病疫苗使用安全性尚欠缺考证。