[发明专利]一种通用型猪蓝耳病毒三重巢式RT-PCR检测引物及方法

权利要求书

1.一种猪蓝耳病毒三重巢式RT-PCR特异性引物，其特征在于：所述引物根据检测猪蓝耳病病毒NSP2基因中碱基序列得到两对带有简并碱基的引物，所述两对引物，分别为外侧引物PRRSV-O-F、PRRSV-O-R和内侧引物PRRSV-I-F、PRRSV-I-R，具体为：

PRRSV-O-F：AATCTTGARGAATGCTTGGC(SEQ ID NO.1)；

PRRSV-O-R：GCTGAGTAYTTTGGGCGTG(SEQ ID NO.2)；

PRRSV-I-F：TTCTTTGATTGGRATGTTGTGC(SEQ ID NO.3)；

PRRSV-I-R：CAAGGAGCTGCTTGAYGACAC(SEQ ID NO.4)；

其中，简并碱基R表示A或G，简并碱基Y表示C或T。

2.一种猪蓝耳病毒三重巢式RT-PCR检测方法，其特征在于：包含以下步骤：

S1、提取待测样品的RNA；

S2、以S1提取的RNA为模板，利用PRRSV-O-F和PRRSV-O-R进行第一轮PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，若无目的条带则进行第二次扩增；

S3、以S2扩增产物为模板，利用PRRSV-I-F和PRRSV-I-R进行第二轮PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，依据目的条带来区分毒株类型。

3.根据权利要求2所述的一种猪蓝耳病毒三重巢式RT-PCR检测方法，其特征在于，S2所述PCR反应体系为：2×1Step Buffer 12.5μl，PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μl，20μmol/L的PRRSV-O-F与20μmol/L的PRRSV-O-R各1μl，RNA模板0.5μl，补加RNase Free dH₂O至25μl；PCR反应程序为：50℃反转录30min，94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸8min。

4.根据权利要求2所述的一种猪蓝耳病毒三重巢式RT-PCR检测方法，其特征在于，S3所述PCR反应体系为：Mix 12.5μl，20μmol/L的PRRSV-I-F与20μmol/L的PRRSV-I-R各1μl，模板1μl，补加RNase Free dH₂O至25μl；PCR反应程序为：94℃预变性2min，98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸8min。

5.根据权利要求4所述的一种猪蓝耳病毒三重巢式RT-PCR检测方法，其特征在于，所述模板为S2中PCR产物稀释50倍。

6.根据权利要求2所述的一种猪蓝耳病毒三重巢式RT-PCR检测方法，其特征在于，S1所述待检测RNA从猪的初乳、精液、血清、组织、恶露等样品中提取。

7.根据权利要求2所述的一种猪蓝耳病毒三重巢式RT-PCR检测方法，其特征在于：S2所述目的条带为1124bp，1034bp或731bp。

8.根据权利要求7所述的一种猪蓝耳病毒三重巢式RT-PCR检测方法，其特征在于：目的条带为1124bp，判定样品中含有猪经典蓝耳病毒；目的条带为1034bp，判定样品中含有猪高致病性蓝耳病毒；目的条带为731bp，判定样品中含有猪类NADC-30蓝耳病毒。

9.根据权利要求2所述的一种猪蓝耳病毒三重巢式RT-PCR检测方法，其特征在于S3所述区分方法具体为：目的条带为1029bp，判定样品中含有猪经典蓝耳病毒；目的条带为939bp，判定样品中含有猪高致病性蓝耳病毒；目的条带为636bp，判定样品中含有猪类NADC-30蓝耳病毒。

10.权利要求1所述引物在制备鉴别猪蓝耳病毒并区分经典毒株、高致病性变异毒株或NADC-30毒株检测试剂盒中的应用。